Lokalisation der Bindungsstelle für Kalium-Kanal-Öffner auf Sulfonylharnstoffrezeptoren:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2001
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LOKALISATION DER BINDUNGSSTELLE
FUER KALIUM-KANAL-OEFFNER AUF SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN
VON DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER TECHNISCHEN
UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG ZUR ERLANGUNG DES GRADES
EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE
D I S S E R T A T I ON
VON
INGO UHDE
AUS
BRAUNSCHWEIG
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG . T. 1
1.1 ABC-PROTEINE 1
1.2 ATP-SENSITIVE KALIUMKANAELE 2
1.2.1 K AT P-KANAELE IN B-ZELLEN DES PANKREAS 3
1.2.2 K A TP-KANAELE IN NEURONEN 4
1.2.3 K ATP -KANAELE IN HERZ-UND SKELETTMUSKEL 4
1.2.4 K AT P-KANAELE IN GLATTER GEFAESSMUSKULATUR 5
1.2.5 STRUKTUR VON K A TP-KANAELEN 5
1.3 SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN 7
1.3.1 EINFUEHRUNG 7
1.3.2 ISOFORMEN UND GEWEBSVERTEILUNG 7
1.3.3 MUTATIONEN IN SUR1 UND K M 6.2 ALS URSACHE FUERPHHI 8
1.4 MODULATOREN DER K AT P-KANALAKTIVITAET 9
1.4.1 SULFONYLHARNSTOFFE 9
1.4.2 KALIUM-KANAL-OEFFNER 11
2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 17
3 MATERIAL UND METHODEN 18
3.1 KULTIVIERUNG, PASSAGIERUNG UND KONSERVIERUNG VON COS-ZELLEN 18
3.1.1 LOESUNGEN UND MEDIEN 18
3.1.2 KULTIVIERUNG VON COS7-ZELLEN 19
3.1.3 KRYOKONSERVIERUNG VON COS-ZELLEN 19
3.1.4 ZELLEN FUER BINDUNGSEXPERIMENTE AN INTAKTEN ZELLEN 20
3.1.5 VIABILITAETSTEST 20
3.2 HERSTELLUNG DER MUTATIONEN UND CHIMAEREN 20
3.2.1 LOESUNGEN 20
3.2.2 PUNKTMUTATIONEN 21
3.2.3 KONTROLLE DES PCR-PRODUKTS 22
3.2.4 VERDAU VON PLASMIDEN FUER DIE DNA-REKOMBINATION 22
3.2.5 ALTERNATIVER EINSCHUB BEI DER DNA-REKOMBINATION 22
I
IMAGE 3
3.2.6 LIGATION 23
3.3 TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 23
3.3.1 LOESUNGEN 23
3.3.2 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN 26
3.3.3 DURCHFUEHRUNG DER TRANSFORMATION 26
3.3.4 PLASMIDPRAEPARATION 27
3.3.5 SEQUENZIERUNG UND SEQUENZANALYSE 27
3.4 TRANSFEKTION 28
3.4.1 LOESUNGEN 28
3.4.2 TRANSFEKTION MITTELS DEAE-DEXTRAN-METHODE 29
3.4.3 HISTOLOGISCHE LAC Z - FAERBUNG 30
3.5 MEMBRANPRAEPARATION 32
3.5.1 LOESUNGEN . .* 32
3.5.2 PRAEPARATION VON MEMBRANEN AUS COS-ZELLEN 33
3.6 PROTEINBESTIMMUNG 33
3.6.1 LOESUNGEN 33
3.6.2 DURCHFUEHRUNG DER PROTEINBESTIMMUNG 33
3.7 BINDUNGSEXPERIMENTE 34
3.7.1 LOESUNGEN FUER DIE BINDUNGSEXPERIMENTE AN COS-MEMBRANEN 34
3.7.2 LOESUNGEN FUER DIE BINDUNGSEXPERIMENTE AN INTAKTEN COS-ZELLEN 34
3.7.3 LOESUNGEN DER RADIOLIGANDEN 35
3.7.4 STAMMLOESUNGEN DER EINGESETZTEN TESTSUBSTANZEN 35
3.7.5 LOESUNGEN DER NUKLEOTIDE 36
3.7.6 LOESUNGEN FUER DIE METABOLISCHE HEMMUNG 36
3.7.7 VORBEREITUNG DER MEMBRANEN 36
3.7.8 VORBEREITUNG DER INTAKTEN ZELLEN 37
3.7.9 GLEICHGEWICHTSBINDUNGSEXPERIMENTE 37
3.8 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE REGISTRIERUNGEN 38
3.8.1 DURCHFUEHRUNG DER ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN EXPERIMENTE 38
3.8.2 LOESUNGEN FUER DIE ELEKTROPHYSIOLQGISCHEN REGISTRIERUNGEN 40
3.8.3 LOESUNGEN DER EINGESETZTEN NUCLEOTIDE ; 41
3.8.4 STAMMLOESUNGEN DER EINGESETZTEN TESTSUBSTANZEN ..: 41
3.8.5 VORBEREITUNG DER ZELLEN 42
3.8.6 AUSWERTUNG DER EXPERIMENTE 42
II
3.9 DATENAUSWERTUNG 43
3.9.1 STATISTIK 43
3.9.2 SPEZIFISCHE BINDUNG 43
3.9.3 KINETIKEN 43
3.9.4 GLEICHGEWICHTSBINDUNGEN 43
3.9.5 DISSOZIATIONSKONSTANTEN 44
3.9.6 ZAHL DER REZEPTOREN 44
3.9.7 KURVENPARAEMETER DER ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN EXPERIMENTE 44
3.9.8 HYDROPATHIE-ANALYSE 45
3.9.9 SEQUENZALIGNMENT 45
4 ERGEBNISSE 46
4.1 BINDUNGSEXPERIMENTE AN INTAKTEN ZELLEN 46
4.1.1 AUFBAU DES ASSAYS 46
4.1.2 KINETIKEN FUER DIE ASSOZIATION VON P1075 UND GLIBENCLAMID 46
4.1.3 EINFLUSS VON MGATP 49
4.1.4 AFFINITAETEN VON KALIUM-KANAL-OEFFNERN AN INTAKTEN ZELLEN 51
4.1.5 AFFINITAETEN VON SULFONYLHARNSTOFFEN AN INTAKTEN ZELLEN 52
4.1.6 KOEXPRESSION MIT KM 6.2 ODER KM 6.1 54
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON SURS 55
4.2.1 HERSTELLUNG EINZELNER PUNKTMUTATIONEN 55
4.2.2 HERSTELLUNG MULTIPLER PUNKTMUTATIONEN 60
4.2.3 BAU VON CHIMAEREN 60
4.3 LOKALISATION DER KCO-BINDUNGSSTELLE 64
4.3.1 ALLGEMEINES 64
4.3.2 CHIMAEREN MIT HOHER AFFINITAET FUER P1075 65
4.3.3 CHIMAEREN MIT NIEDRIGER AFFINITAET FUER P1075 67
4.3.4 KRITISCHE REGIONEN IN TMD2 68
4.3.5 AFFINITAETEN FUER DIE BINDUNG VON KCOS AN CHIMAERE XVIII 70
4.4 KRITISCHE BEREICHE IN KCO I UND KCO II 72
4.4.1 ALLGEMEINES 72
4.4.2 UNTERSUCHUNG VON KCO I (AMINOSAEUREN 1059 - 1087 IN SUR2B) 72
4.4.3 UNTERSUCHUNG VON KCO II (AMINOSAEUREN 1218 - 1320 IN SUR2B) 75
4.4.4 BEDEUTUNG VON METHIONIN 1290 IN SURL FUER DIE KCO-BINDUNG 81
4.4.5 WEITERE CHARAKTERISIERUNG VON KCO II IN SUR2B DURCH CHIMAEREN 82
III
IMAGE 4
4.5 FUNKTIONELLE RELEVANZ DER BEREICHE KCO I UND KCO II :...-. 83
^ T ) I C L C I I ^ ^ I ON ********
**************************************** OEO
5.1 AFFINITAET INTAKTER ZELLEN FUER DIE BINDUNG VON KCOS UND SHS 86
5.2 LOKALISATION DER KCO-BINDUNGSSTELLE AUF SUR2B 88
5.3 AMINOSAEUREN MIT KRITISCHER BEDEUTUNG FUER DIE BINDUNG VON KCOS 90
5.4 SUR2B TI253 ENTSPRICHT DEM FUER DIE SUBSTRATBINDUNG ESSENTIELLEN
VALIN98I IN PGP.. 93
6 ZUSAMMENFASSUNG 95
7 LITERATURVERZEICHNIS 98
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
IV
ABB.
ADP
ABC-PROTEIN
AS
ATP
BIDEST.
BMAX
B P
BSA
BZW.
CFTR
COS
ET
DEAE
D.H.
DMEM
DMSO
DNA
DS
EC50
EDTA
FA.
FKS
G GDP
GK
GLUC
3 H
HBSS
HEPES
IC 50
KB
KCO
ABBILDUNG
ADENOSIN-5 -DIPHOSPHAT
ATP-BINDENDES KASSETTENPROTEIN
AMINOSAEURE
ADENOSIN-5 -TRIPHOSPHAT
BIDESTILLIERT
ANZAHL DER BINDUNGSSTELLEN
BASENPAAR
BOVINE SERUM ALBUMIN (RINDERSERUMALBUMIN)
BEZIEHUNGSWEISE
CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR
CV1, ORIGIN OF SV40 (S. 3.1.2.)
CARBOXY-TERMINUS
DIETHYLAMINOETHANOL
DAS HEISST
DULBECCO MODIFIZIERTES EAGLE MEDIUM
DIMETHYLSULFOXID
DESOXYRIBONUKLEINSAEURE
DOPPELSTRAENGIG (DS DNA)
HALBMAXIMAL-WIRKSAME SUBSTANZKONZENTRATION
ETHYLENDIAMINTETRAESSIGSAEURE
FIRMA
FOETALES KAELBERSERUM
GRAVITATIONSBESCHLEUNIGUNG (9,81 M/SEC 2)
GUANOSIN-5 -DIPHOSPHAT
GLUCOKINASE
GLUCOSE
TRITIUM (ISOTOP DES WASSERSTOFFS)
HEPES BUFFERED SALINE SOLUTION
[4-(2-HYDROXYETHYL)-PIPERAZINO]-ETHANSULFONSAEURE
HALBMAXIMAL-INHIBITORISCHE SUBSTANZKONZENTRATION
KILOBASEN; ENTSPRECHEND 1000 BASENPAAREN
K +-CHANNEL OPENER (KALIUM-KANAL-OEFFNER)
V
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