Untersuchung der transkriptionellen Regulierung sowie Erzeugung einer Knockout-Mutation des neuronalen Plastizitäts-Gens arg3.1/arc:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
6
2.
EINLEITUNG
7
2.1
LERNEN
UND
GEDAECHTNIS
7
2.2
MOLEKULARE
MECHANISMEN
BEI
SYNAPTISCHER
PLASTIZITAET
9
2.3
TRANSKRIPTIONELLE
REGULATION
DER
AKTIVITAETSABHAENGIGEN
GENE
10
2.4
DAS
GEN
ARG3.1/ARC
13
2.5
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
14
3.
ERGEBNISSE
16
3.1
ERZEUGUNG
VON
ARG3.1/ARC
+/
'
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
16
3.1.1
KLONIERUNG
DES
ARG3.1/ARC-GENS
DER
MAUS
16
3.1.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
ARG3.1/ARC-GENSORTES
UND
ANALYSE
DER
MOLEKULAREN
STRUKTUR
19
3.1.3
KLONIERUNG
DES
TARGETING
VECTORS
FUER
DIE
KNOCKOUT-MUTATION
DES
ARG3.1/ARC-GENS
21
3.1.4
IDENTIFIZIERUNG
DER
HOMOLOG
REKOMBINIERTEN
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
25
3.1.5
WEITERER
VERLAUF
DES
KNOCKOUT-MAUS-PROJEKTES
28
3.2 PHARMAKOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DES
ARG3.1/ARC-INDUKTIONSPFADES
30
3.2.1
TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVIERUNG
VON
ARG3.1/ARC
DURCH
MEMBRANDEPOLARISATION
30
3.2.2
TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVIERUNG
VON
ARG3.1/ARC
DURCH
CAMP
33
3.2.3
UNTERSUCHUNG
VON
MRNA-NEUSYNTHESE
VERSUS
POSTTRANSKRIPTIONALER
REGULIERUNG
35
3.2.4
ARG3.1/ARC-MRNA-INDUKTION
NACH
INHIBITION
VON
VSCC,
PKA
UND
MEK
IN
PC
1
2-ZELLEN
37
3.2.5
ARG3.1/ARC-MRNA-INDUKTION
NACH
INHIBITION
VON
PKA
UND
MEK
IN
HIPPOCAMPUS-NEURONEN
40
3.3
GENETISCHE
UNTERSUCHUNG
DES
INDUKTIONSPFADES
42
3.3.1
ANALYSE
DER
KONSENSUS-SEQUENZEN
IM
ARG3.1/ARC-GEN
42
3.3.2
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
BASALEN
ARG3.1/ARC-MRNA-EXPRESSION
45
3.3.3
STABILE
TRANSFEKTION
VON
ARG3.1/ARC-KONSTRUKTEN
UND
DEREN
INDUKTION
49
4.
DISKUSSION
53
4.1
ARG3.1/ARC
+/
'EMBRYONALE
STAMMZELLEN
WURDEN
ERZEUGT
53
4.2
DIE
ARG3.1/ARC-MRNA-INDUKTION
DURCH
CALCIUM
UND
CAMP
ERFORDERT
PKA
UND
MEK,
IST
ABER
UNABHAENGIG
VON
CREB
54
4.3
WEDER
SRE
NOCH
CRE
SIND
DIE
REGULATORISCHEN
ELEMENTE
DER
ARG3.1/ARC-MRNA-INDUKTION
59
4.4
AUSBLICK
62
5.
EXPERIMENTELLE
METHODEN
64
5.1
MATERIALIEN
64
5.1.1
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
MEDIUM,
KITS
64
5.1.2
LOESUNGEN,
PUFFER
UND
NAEHRMEDIEN
64
5.1.3
VEKTOREN
UND
OLIGONUKLEOTIDE
68
5.1.4
BAKTERIENSTAEMME
UND
PHAGENBIBLIOTHEK
69
5.1.5
EUKARYONTISCHE
ZELLINIEN
69
5.2
KULTUR
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
70
5.2.1
KULTURBEDINGUNGEN
70
5.2.2
SPLITTEN
70
5.2.3
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
70
5.2.4
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MIT
REPORTERPLASMIDEN
71
5.2.5
STABILE
TRANSFEKTION
UND
SELEKTION
REKOMBINANTER
ZELLINIEN
71
5.2.6
SERUMSTIMULATION
72
5.2.7
PHARMAKOLOGISCHE
STIMULATION
UND
INHIBITION
72
5.3
KULTUR
VON
BAKTERIEN
UND
PHAGEN
72
5.3.1
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
BAKTERIEN
72
5.3.2
TRANSFORMATION
ELEKTROKOMPETENTER
BAKTERIEN
73
5.3.3
AUSPLATTIEREN
DER
BAKTERIOPHAGEN-BIBLIOTHEK
73
5.3.4
FILTERABZUEGE
VON
DEN
AUSPLATTIERTEN
BAKTERIOPHAGEN
74
5.3.5
ANALYSE
DER
FILTERABZUEGE
UND
ISOLIERUNG
POSITIVER
PHAGEN
74
5.3.6
FLUESSIGKULTUREN
VON
BAKTERIOPHAGEN
74
5.4
DNA:
PRAEPARATION,
MANIPULATION
UND
ANALYSE
75
5.4.1
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
75
5.4.2
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
AUS
FLUESSIGKULTUREN
75
5.4.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
TRANSFEKTIERTEN
BAKTERIEN
75
5.4.3.1
PRAEPARATION
MIT
LITHIUM-LYSEPUFFER
75
5.4.3.2
PRAEPARATION
MIT
IONENAUSTAUSCHER-SAEULEN
76
5.4.4
SEQUENZIEREN
VON
PLASMID-DNA
76
5.4.5
RESTRIKTIONSVERDAU
76
5.4.6
AUFFUELL
UND
ABDAUREAKTION
77
5.4.7
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
KLONIERUNGSVEKTOREN
77
5.4.8
LIGATION
77
5.4.9
NESTED
DELETION-LA
'
AT&GZNE.SE
77
5.4.10
DNA-ELEKTROPHORESE
IM
AGAROSEGEL
78
5.4.11
EXTRAKTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
78
5.4.12
RADIOAKTIVES
MARKIEREN
VON
CDNA
UND
OLIGONUKLEOTIDEN
78
5.4.13
HERSTELLUNG
VON
SOUTHEM-BLOTS
79
5.4.14
HYBRIDISIEREN
VON
DNA-FILTERN
79
5.5
RNA:
PRAEPARATION
UND
ANALYSE
80
5.5.1
RNA-ISOLIERUNG
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
80
5.5.2
S
1-ENDONUKLEASE-ANALYSE
DES
5
'
ENDES
VON
MRNA
80
4
81
5.5.3
RNA-GELELEKTROPHORESE,
HERSTELLUNG
VON
NORTHEM-BLOTS
UND
DEREN
HYBRIDISIERUNG
5.6
PROTEINE:
ANALYSE
81
5.6.1
LUCIFERASE-AKTIVITAETSMESSUNG
81
6.
LITERATUR
83
DANKSAGUNG
88
LEBENSLAUF
89
ERKLAERUNG
90
5 |
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