Effekte von Weihrauchextrakten und Boswelliasäuren auf die Aktivitäten von NADPH-Oxidase, Caspase-1 und Humane Leukozytenelastase:
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2001
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EFFEKTE VON WEIHRAUCHEXTRAKTEN
UND BOSWELLIASAEUREN AUF DIE AKTIVITAETEN VON NADPH-OXIDASE, CASPASE-1 UND
HUMANE LEUKOZYTENELASTASE
DISSERTATION
DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND PHARMAZIE DER EBERHARD-KARLS-UNIVERSITAET
TUEBINGEN ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
2001
VORGELEGT VON KIRSTIN HEIL
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VII
1 EINLEITUNG 1
1.1 LEUKOZYTEN UND IHRE ABWEHRFUNKTIONEN 1
1.2 NADPH-OXIDASE UND REAKTIVE SAUERSTOFFSPEZIES 2
1.2.1 BESTANDTEILE DES NADPH-OXIDASE-KOMPLEXES 3 1.2.1.1 P47PHOX .-. 3
1.2.1.2 P67PHOX Y 4
1.2.1.3 P40PHOX 6
1.2.1.4 P21RAC 7
1.2.1.5 CYTOCHROM B 55 8: P22PHOXUNDGP91PHOX 7
1.2.1.6 RAPIA 8
1.2.2 AKTIVIERUNG UND REGULATION DER NADPH-OXIDASE 8 1.2.2.1
STIMULATOREN DER SAUERSTOFFRADIKALBILDUNG 8
1.2.2.2 AKTIVIERENDE UND REGULATORISCHE KINASEN 10
1.3 5-LIPOXYGENASE 14
1.4 HUMANE LEUKOZYTENELASTASE 15
1.5 CASPASEN IN ENTZUENDUNG UND APOPTOSE 16
1.6 WEIHRAUCH UND BOSWELLIASAEUREN 17
1.6.1 PHARMAKOLOGISCHE EFFEKTE 17
1.6.2 KLINISCHE UNTERSUCHUNGEN 19
1.7 FRAGESTELLUNG 20
1.7.1 NADPH-OXIDASE 20
1.7.2 HUMANE LEUKOZYTENELASTASE 21
1.7.3 CASPASE-1 21
1.7.4 5-LIPOXYGENASE *. 21
2 MATERIAL 23
2.1 VERSUCHSTIERE 23
2.2 BUFFY COATS.._ 23
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.3 GERAETE 23
2.3.1 ZENTRIFUGEN 23
2.3.2 ELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOTTING 23
2.3.3 SONSTIGE GERAETE 23
2.4 CHEMIKALIEN 24
2.5 LOESUNGEN 26
2.5.1 LOESUNGEN ZUR GEWINNUNG VON ZELLEN 26
2.5.1.1 PBS (MODIFIZIERT NACH DULBECCO) 26
2.5.1.2 GLYKOGENLOESUNG 26
2.5.1.3 AMMONIUMCHLORID-LYSEPUFFER 26
2.5.1.4 DEXTRANLOESUNG (2%) 26
2.5.1.5 INKUBATIONSPUFFER (IKP) 26
2.5.1.6 TRYPANBLAU-LOESUNG 0,5% 27
2.5.2 WEIHRAUCHEXTRAKTE 27
2.5.3 LOESUNGEN VON EINZELNEN WEIHRAUCHINHALTSSTOFFEN 27
2.5.4 LUMINOMETRISCHE MESSUNG DER NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET 27 2.5.4.1
LUMINOL-LOESUNG : 27
2.5.4.2 FMLP-LOESUNG (80 MM) 28
2.5.4.3 CYTOCHALASIN-B-LOESUNG 28
2.5.4.4 PMA-LOESUNG 28
2.5.4.5 CALCIUMCHLORID-LOESUNG (150 MM) 28
2.5.4.6 LONOPHOR-LOESUNG (2MM) 28
2.5.5 KINASE-INHIBITOR-LOESUNGEN 29
2.5.5.1 WORTMANNIN (2 MM) 29
2.5.5.2 SKF-86002 (10 MM) 29
2.5.5.3 SB 203580 (10 MM) 29
2.5.5.4 PD 98059 (20 MM) 29
2.5.5.5 U0126(2MM) .....29
2.5.6 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET 30 2.5.6.1
AZIDHALTIGER PBS 30
2.5.6.2 BRADFORD STAMMLOESUNG ZUR PROTEINBESTIMMUNG 30 2.5.6.3 BRADFORD
ARBEITSPUFFER ZUR PROTEINBESTIMMUNG 30 2.5.6.4 BSA-STAMMLOESUNG 1 MG/ML
ZUR ERSTELLUNG DER EICHGERADEN 30 2.5.6.5 PMA-LOESUNG ZUR
TRANSLOKATIONSSTIMULATION 30
2.5.6.6 SUCROSELOESUNG (0,25 M) 30
2.5.6.7 KALIUMPHOSPHATPUFFER 31
2.5.6.8 CYTOCHROM C-LOESUNG 1 MM 31
2.5.6.9 DEOXYCHOLAT-LOESUNG 10% 31
2.5.6.10 NADPH-LOESUNG 1 MM 31
2.5.6.11 SUPEROXIDDISMUTASE-LOESUNG 31
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.7 GEWINNUNG VON 100.000 X G - UEBERSTAENDEN 31
2.5.7.1 KAVITATIONSPUFFER 31
2.5.7.2 KATALASE-LOESUNG 32
2.5.7.3 DTT-LOESUNG (50 MM) 32
2.5.8 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DER 5-LO 32 2.5.8.1
ATP-AGAROSE-SAEULE 32
2.5.8.2 PBS MIT NAN 3 0,01% 32
2.5.8.3 PHOSPHATPUFFER 50 MM 32
2.5.8.4 DTT-LOESUNG (50 MM) 33
2.5.8.5 KATALASE-LOESUNG 33
2.5.8.6 EQUILIBRIERUNGSPUFFER 33
2.5.8.7 PUFFER FUER DIE SALZWAESCHE .33
2.5.8.8 ATP-LOESUNG 20 MM 33
2.5.8.9 HARNSTOFFLOESUNG 6N 33
2.5.8.10 SDS-LOESUNG 20% 34
2.5.9 5-LIPOXYGENASE-GRB2-BINDUNGSVERSUCHE 34
2.5.9.1 OVALBUMIN-LOESUNG 34
2.5.9.2 CALCIUMCHLORID-LOESUNG (90 MM) 34
2.5.9.3 PHOSPHATIDYLCHOLIN-LOESUNG 34
2.5.10 SDS-PAGE 34
2.5.10.1 SDS-LOESUNG (10%) 34
2.5.10.2 AMMONIUMPERSULFATLOESUNG 34
2.5.10.3 TRIS-PUFFER PH 8,8 (1,5 M) 35
2.5.10.4 TRIS-PUFFER PH 6,8 (0,5 M) 35
2.5.10.5 10X ELEKTRODENPUFFER 35
2.5.10.6 5X LAEMMLI-PUFFER 35
2.5.10.7 MARKER FUER SDS-PAGE 36
2.5.11 WESTERN BLOT 36
2.5.11.1 10X TRANSFERPUFFER 36
2.5.12 NATIVE GELELEKTROPHORESE 36
2.5.12.1 TRIS-PUFFER PH 6,8 (1 M) 36
2.5.12.2 10X ELEKTRODENPUFFER OHNE SDS 37.
2.5.12.3 5X PROBENPUFFER 37
2.5.13 ANTIKOERPER-LOESUNGEN 37
2.5.13.1 PUFFER FUER ANTIKOERPER 37
2.5.13.2 PRIMAERER 5-LIPOXYGENASE-ANTIKOERPER 37
2.5.13.3 SEKUNDAERER ANTIKOERPER (ANTI-KANINCHEN-IGG) 37 2.5.13.4 PRIMAERER
GRB2-ANTIKOERPER 38
2.5.13.5 SEKUNDAERER ANTIKOERPER (ANTI-MAUS-IGG) 38
2.5.14 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER HLE-AKTIVITAET 38 2.5.14.1 HLE 38
2.5.14.2 HLE-SUBSTRAT 38
IMAGE 4
IV
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.15 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER CASPASE-1 -AKTIVITAET 38 2.5.15.1
ARBEITSPUFFER 38
2.5.15.2 CASPASE-1 39
2.5.15.3 CASPASE-1-SUBSTRAT 39
2.5.15.4 ARACHIDONSAEURELOESUNG (200 MM) 39
3 METHODEN 41
3.1 GEWINNUNG VON ZELLEN 41
3.1.1 GEWINNUNG VON RATTEN-PMNL 41
3.1.2 GEWINNUNG VON HUMANEN PMNL 41
3.2 TESTSYSTEME FUER DIE MESSUNG DER NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET 42
3.2.1 CHEMOLUMINESZENZMESSUNG AN DER INTAKTEN ZELLE 42
3.2.2 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET AN DER
NADPH-OXIDASE-ANGEREICHERTEN MEMBRANFRAKTION 44 3.2.2.1 PRAEPARATION UND
AKTIVIERUNG 44
3.2.2.2 FRAKTIONIERUNG 44
A) HOMOGENISATION 44
B) DIFFERENZIALZENTRIFUGATION 44
3.2.2.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 44
3.2.2.4 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAET 45
3.3 TESTSYSTEME FUER DIE 5-LIPOXYGENASE-BINDUNGSUNTERSUCHUNGEN 46
3.3.1 GEWINNUNG VON 100.000 X G-UEBERSTAENDEN 46
3.3.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DER 5-LO 46
3.3.3 5-LIPOXYGENASE-GRB2-BINDUNG: AGAROSEFAELLUNG 47 3.3.3.1 INKUBATION
UND PRAEZIPITATION 47
3.3.3.2 SDS-PAGE 48
3.3.3.3 WESTERN BLOT 48
3.3.4 5-LIPOXYGENASE-GRB2-BINDUNG: ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DES
PROTEINKOMPLEXES 49
3.3.4.1 INKUBATION 49
3.3.4.2 NATIVE GELELEKTROPHORESE 49
3.3.4.3 WESTERN BLOT 50
3.4 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER HLE-AKTIVITAET 50
3.5 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER CASPASE-1-AKTIVITAET 51
3.6 STATISTIK 51
INHALTSVERZEICHNIS V
4 ERGEBNISSE : 53
4.1 SAUERSTOFFRADIKALBILDUNG NEUTROPHILER GRANULOZYTEN 53
4.1.1 METHODISCHE ERGEBNISSE 53
4.1.1.1 STIMULATOR-UND PRIM/NG-EFFEKTE 54
4.1.1.2 CALCIUMEFFEKTE 61
..1,1.3 STIMULATORKONZENTRATIONEN 64
4.1.1.4 WEITERE STIMULATOREFFEKTE 65
4.1.2 PERITONEALE RATTEN-PMNL 66
4.1.2.1 EFFEKTE DIVERSER KINASE- UND 5-LIPOXYGENASE-LNHIBITOREN AUF DIE
O 2 -PRODUKTION 66
4.1.2.2 EFFEKTE VON TRITERPENEN AUF DIE FMLP-UND PMA-STIMULIERTE
(V -PRODUKTION 71
4.1.2.3 EIGENSTIMULATION DURCH TRI*ERPENE 84
4.1.3 HUMANE PMNL 86
4.1.3.1 EFFEKTE DIVERSER KINASE-INHIBITOREN AUF DIE (V -PRODUKTION 86
4.1.3.2 EFFEKTE VON TRITERPENEN AUF DIE FMLP-UND PMA-STIMULIERTE
OV -PRODUKTION !: 90
4.1.3.3 EIGENSTIMULATION DURCH TRITERPENE 100
4.1.3.4 EFFEKTE VON 5-AMINOSALICYLSAEURE (MESALAZIN) AUF DIE FMLP-
STIMULIERTE (V -PRODUKTION HUMANER PMNL 101
4.1.4 PHOTOMETRISCHE MESSUNG DER NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET AN DER
NADPH-OXIDASE-ANGEREICHERTEN MEMBRANFRAKTION 103
4.2 5-LIPOXYGENASE-GRB2-BINDUNGSUNTERSUCHUNGEN 105
4.3 HUMANE LEUKOZYTENELASTASE 107
4.4 CASPASE-1 110
5 DISKUSSION 115
5.1 NADPH-OXIDASE 115
5.1.1 DISKUSSION DER METHODISCHEN ERGEBNISSE 115
5.1.1.1 GEWAEHLTE METHODEN 115
5.1.1.2 VERGLEICH DER 0 2 -PRODUKTION VON RATTEN-PMNL UND HUMANEN PMNL
BEIFMLP- UND PMA-STIMULATION 116 5.1.1.3 CYTOCHALASIN B 118
5.1.1.4 ROLLE VON CALCIUM 119
5.1.2 EFFEKTE DER KINASE-INHIBITOREN 121
5.1.2.1 PI3KINASE: WORTMANNIN 121
5.1.2.2 P38-MAPK: SKF-86002 UND SB 203580 122
5.1.2.3 ERK-1/2: PD 98059 UND U 0126 124
5.1.3 EFFEKTE DER LIPOXYGENASE-INHIBITOREN 127
IMAGE 5
VI INHALTSVERZEICHNIS
5.1.4 EFFEKTE DER TRITERPENE 128
5.2 5-LIPOXYGENASE-GRB2-BINDUNGSUNTERSUCHUNGEN 130
5.3 HUMANE LEUKOZYTENELASTASE 131
5.4 CASPASE-1 *. 132
5.5 WIRKUNGEN VON BOSWELLIASAEUREN AUF 5-LO, HLE, CASPASE-1 UND O 2
-PRODUKTION IM VERGLEICH 134
5.6 BEDEUTUNG DER ERGEBNISSE FUER DIE KLINISCHE WIRKSAMKEIT VON
WEIHRAUCHEXTRAKTEN 135
6 ZUSAMMENFASSUNG 137
6.1 NADPH-OXIDASE 137
6.1.1 EFFEKTE VON WEIHRAUCHEXTRAKTEN UND BOSWELLIASAEUREN AUF DIE
NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET 137
6.1.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR AKTIVIERUNG DER NADPH-OXIDASE 138 6.1.2.1
EINFLUSS VON STIMULATOR, PRIMINGUNAE SPEZIES 138 6.1.2.2
KINASEBETEILIGUNG 139
6.2 HUMANE LEUKOZYTENELASTASE 140
6.3 CASPASE-1 140
6.4 5-LIPOXYGENASE-GRB2-BINDUNGSUNTERSUCHUNGEN 141
6.5 WIRKUNGEN VON WEIHRAUCHEXTRAKTEN UND BOSWELLIASAEUREN IM UEBERBLICK
141
7 LITERATUR 143
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