Aktivitätsregulierung sowie kinetische Charakterisierung und molekulare Grundlagen der Expression der plasmamembrangebundenen Nitratreduktase bei Tabak:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2000 (Nur als Mikrofiche für den Austausch) |
| Beschreibung: | 115 Bl. Ill., graph. Darst. : 30 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 NITRATAUFNAHME 1
1.2 NITRATREDUKTION 2
1.2.1 STRUKTUR DER NR 3
1.2.2 REGULATION DER NITRATREDUKTION 4
1.2.3 NITRATASSIMILATION UND C-STOFFWECHSEL 5
1.2.4 LOKALISATION DER NR 6
1.3 FRAGESTELLUNG DER ARBEIT 8
2 MATERIAL UND METHODEN 9
2.1 PFLANZENMATERIAL 9
2.2 ANZUCHTBEDINGUNGEN 9
2.2.1 ANZUCHT DER GERSTE 9
2.2.2 ANZUCHT DES TABAKS 10
2.3 PLASMAMEMBRANPRAEPARATION 11
2.3.1 PRAEPARATION VON MIKROSOMEN 11
2.3.2 ISOLIEREN DER PLASMAMEMBRAN UEBER DIE VERTEILUNG IM
ZWEIPHASEN-POLYMERSYSTEM 12
2.4 PROTEINBESTIMMUNG 14
2.5 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAETEN 15
2.5.1 BESTIMMUNG DER YYGESAMT-REAKTION" DER PM-NR 15
2.5.1.1 MESSUNG DER NADH- BZW. SUCC-PM-NR
IN VITRO 15
2.5.1.2 MESSUNG DER SUCCPM-NR-AKTIVITAET NACH
TRYPSINBEHANDLUNG 16
2.5.2 MESSUNGEN VON PARTIALREAKTIONEN DER PM-NR 16
2.5.2.1 FERRICYANID-REDUKTASE 16
2.5 2.2 FADH
2 ALS ELEKTRONENDONATOR 17
2.5.2.3 CYTOCHROM C-REDUKTION MIT SUCCINAT 17
2.5.2.4 METHYLVIOLOGENRED ALS ELEKTRONENDONATOR 18
2.5.2.5 BROMPHENOLBLAU ALS ELEKTRONENDONATOR 18
2.5.3 ENZYMATISCHER NACHWEIS DES PHOSPHORYLIERUNGSZUSTANDS
DER NR 19
2.5.4 MESSUNG DER VANADAT-SENSITIVEN K
+ / MG2+-ATPASE 20
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.6
IN S/FUE-BESTIMMUNG DER SUCCPM-NR-AKTIVITAET IN WURZELN VON TABAK
UND GERSTE 21
2.6.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR LOKALISATION DER SUCCPM-NR IN DER
WURZEL VON GERSTE UND TABAK
IN SITU 22
2.7 BESTIMMUNG DES NITRATGEHALTES IN VERSCHIEDENEN WURZEL
ABSCHNITTEN 24
2.8 FLUORESZENZ-SPEKTROSKOPIE 24
2.8.1 FLUORESZENZ-DEPOLARISATION ZUR MESSUNG TEMPERATUR
INDUZIERTER PHASENUEBERGAENGE AN PLASMAMEMBRANVESIKELN 25
2.8.2 EXCIMEREN-TECHNIK ZUR MESSUNG TEMPERATURINDUZIERTER
PHASENSEPARATION AN PLASMAMEMBRANVESIKELN 26
2.9 RNA-ISOLIERUNG 27
2.9.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 27
2.9.2 REINIGUNG VON POLY A
+-RNA (MRNA) AUS GESAMT-RNA MIT
DEM OLIGOTEX MRNA MINI KIT VON QUIAGEN 28
2.10 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 29
2.10.1 REVERSE TRANSKRIPTASE-REAKTION (RT-REAKTION) 29
2.10.2 AUSWAHLKRITERIEN FUER DIE OLIGONUKLEOTIDPRIMER BEI DER
PCR-REAKTION
30
2.10.3 DURCHFUEHRUNG DER PCR
31
2.10.3.1 UNTERSUCHUNG DER OPTIMALEN ANLAGERUNGSTEMPERATUR
FUER DIE VERWENDETEN PRIMER ZUR HERSTELLUNG DES
913 BP-FRAGMENTS UEBER EINE PCR 32
2.10.3.2 MARKIERUNGSREAKTION DES 913 BP-FRAGMENTS MIT
BIOTIN ZUR HERSTELLUNG EINER SONDE 33
2.10.4 3'-RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS ,,3'-RACE" 34
2
.
10.5
ANALYSE DER PCR-PRODUKTE 36
2.10.6 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS DEM AGAROSE-GEL 36
2.11 NORTHERN BLOTTING
37
2.11.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 37
2.11.2 TRANSFER DER NUKLEINSAEUREN 38
2.11.3 HYBRIDISIERUNG 38
2.11.4 NACHWEIS VON NUKLEINSAEUREN 39
2.11.5 ENTFERNUNG VON GEBUNDENER DNAE-SONDE YYSTRIPPING" 40
3 ERGEBNISSE 4^
3.1 EIGENSCHAFTEN UND APPARENTE REGULATION DER SUCCPM-NR 41
3.1.1 TEMPERATURWIRKUNG
41
3.1.1.1 TEMPERATUROPTIMA VON LOESLICHER UND PM-NR BEI
TABAK UND GERSTE IN BLATT UND WURZEL 41
3.1.1.2 AKTIVITAET DER SUCCPM-NR IN ABHAENGIGKEIT VON
PH-WERT, TEMPERATUR UND NITRATERNAEHRUNG BEI TABAK UND
GERSTE IN BLATT UND WURZEL
43
3.1.1.3 UNTERSUCHUNG ZUR REVERSIBILITAET DES PH-OPTIMUMS DER
SUCCPM-NR BEI 50C 46
3.
1.1.4 AKTIVIERUNGSENERGIE VON SUCCINAT- UND
NADH-ABHAENGIGER PM-NR IN TABAKWURZELN 49
3.
1.1.5 TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER PARTIALREAKTIONEN IN
DER PLASMAMEMBRANFRAKTION VON TABAKWURZELN 50
3.1.1
.6 THERMOTROPES PHASENVERHALTEN VON PLASMAMEMBRAN-
VESIKELN
51
3.1.2 AFFINITAET DER SUCCPM-NR ZU DEN BEIDEN SUBSTRATEN SUCCINAT
UND NITRAT
54
3.1.3 PHOSPHORYLIERUNGSZUSTAND DER SUCCPM-NR 55
3.1.4 HEMMUNG DER PM-NR-AKTIVITAET DURCH DIPHENYLENIODONIUM-
CHLORID 56
3.1.5 HEMMUNG DER SUCCPM-NR-AKTIVITAET DURCH OXALACETAT
UND MALONAT 57
3.1.6 KINETISCHE ANALYSE ZUM REAKTIONSMECHANISMUS DER
SUCCPM-NR 60
3. ZELLULAERE ORIENTIERUNG UND LOKALISATION DER SUCCPM-NR 62
3.2.1 ORIENTIERUNG DER SUCCPM-NR IN DER PLASMAMEMBRAN 62
3.2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR VERTEILUNG DER SUCCPM-NR-AKTIVITAET
UND VON NO
3' IN DER WURZEL 66
3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER SUCCPM-NR 72
3.3.1 NORTHERNBLOT-ANALYSE VON MRNA DER TABAKWURZEL
MIT SPEZIFISCHEN GENSONDEN DER 3'- ODER 5'-TERMINALEN REGION
DES
NIA-GENS DER CYTOSOLISCHEN NITRATREDUKTASE 72
3.3.2 ZIRKADIANE AENDERUNG DER GENEXPRESSION DER NR 74
3.3.3 SEQUENZANALYSE NACH 3'-RACE 75
4 DISKUSSION 77
4.1 EIGENSCHAFTEN UND REGULATION DER SUCCPM-NR 77
4.1.1 VERGLEICH DER TEMPERATURABHAENGIGKEIT ZWISCHEN PM-NR UND
CYTOSOLISCHER NR 77
4.1.2 TEMPERATUREINFLUESSE AUF PLASMAMEMBRANLIPIDE UND
PLASMAMEMBRANPROTEINE AM BEISPIEL DER SUCCPM-NR 79
4.1.3 REGULATION DER SUCCPM-NR DURCH DEN PH-WERT 81
4.1.4 ELEKTRONENUEBERTRAGUNG VON SUCCMAT AUF DIE SUCCPM-NR 84
4.1.5 HEMMUNG DER SUCCPM-NR DURCH MALONAT UND OXALACETAT 85
4.1.6 WIRD DIE PM-NR WIE DIE CYTOSOLISCHE NR POSTTRANSLATIONAL
DURCH PHOSPHORYLIERUNG REGULIERT ? 86
4.1.7 PING PONG BI BI-REAKTIONSMECHANISMUS DER SUCCPM-NR 87
4.2 LOKALISATION DER SUCCPM-NR 88
4.2.1 ORIENTIERUNG AN DER PLASMAMEMBRAN 88
4.2.2 LOKALISATION IN DER WURZEL 89
4.3 WIRD DIE SUCCPM-NR VON EINEM EIGENEN GEN CODIERT ODER IST SIE EIN
POSTTRANSLATIONAL MODIFIZIERTES PRODUKT DER CYTOSOLISCHEN NR ? 91
6 ZUSAMMENFASSUNG 96
7 LITERATUR 98
8 ANHANG 111 |
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