Identifizierung von zusätzlichen Proteinen, die an der Repression des Transkriptionsfaktors AP-1 durch den Glukokortikoidrezeptor beteiligt sind:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe
2001
|
| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Wissenschaftliche Berichte / Forschungszentrum Karlsruhe Technik und Umwelt
6587 |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2000 |
| Beschreibung: | 139 S. graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
.
3
ABSTRACT
.
4
ABKUERZUNGEN
.
9
1
EINLEITUNG
.
13
1.1
DER
GLUKOKORTIKOIDREZEPTOR
VERMITTELT
DIE
WIRKUNG
DES
STERIODHORMONS
IN
DEN
ZIELZELLEN
.
14
1.2
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
DURCH
DEN
GLUKOKORTIKOIDREZEPTOR
.
15
1.2.1
DER
GLUKOKORTIKOIDREZEPTOR
ALS
LIGANDENABHAENGIGER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
(TRANSAKTIVIERUNG)
.
15
1.2.2
REPRESSION
VON
GENEN
DURCH
DEN
GR
(TRANSREPRESSION)
.
18
1.3
ZUSAETZLICHE
PROTEINE
SIND
NOTWENDIG
UM
AP-1
REPRESSION
DURCH
DEN
GR
ZU
VERMITTELN
.
25
1.4
MIT
HILFE
EINES
ZWEI-HYBRID
SYSTEMS
KOENNEN
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
ZWEI
PROTEINEN
IDENTIFIZIERT
WERDEN
.
26
1.5
ZIELSETZUNG
.
28
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
29
2.1
MATERIAL
.
29
2.1.1
CHEMIKALIEN
UND
BEZUGSQUELLEN.
29
2.1.2
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
,
.
31
2.1.3
ENZYME
.
32
2.1.4
BAKTERIEN
UND
HEFESTAEMME
.
32
2.1.5
ZELLINIEN
UND
KULTURBEDINGUNGEN
.
32
2.1.6
KULTURMEDIEN
FUER
HEFEN
UND
BAKTERIEN
.
33
2.1.6.1
HEFEMEDIEN.
33
2.1.6.2
MEDIEN
FUER.
COLI
KULTUREN
.
34
2.1.7
PLASMIDE
.
34
2.1.7.1
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
34
2.1.7.2
HEFEPLASMIDE
.
38
2.1.7.3
PLASMIDE
FUER
IN
VITRO
TRANSLATION
.
39
2.1.7.4
PLASMIDE
FUER
DIE
PRODUKTION
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
.
40
2.1.7.5
PLASMIDE
FUER
DIE
PRODUKTION
VON
HIS-FUSIONSPROTEINEN
.
40
2.1.7.6
REPORTER
.
40
2.1.8
OLIGONUKLEOTIDE
.
41
2.1.8.1
ZUR
VERWENDUNG
IN
DER
PCR:
.
41
2.1.8.2
ZUR
SEQUENZIERUNG
VON
TRIP6:
.
41
2.1.8.3
ZUR
SEQUENZIERUNG
DER
GENBANKPLASMIDE:
.
41
2.1.9
ANTIKOERPER
.
41
2.2
METHODEN
.
43
2.2.1
ZELLKULTUR
UND
TRANSFEKTIONSMETHODEN
.
43
2.2.1.1
KULTURBEDINGUNGEN
.
43
2.2.1.2
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
.
43
2.2.1.3
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
43
2.2.1.4
KALZIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
.
43
2.2.1.5
TRANSFEKTION
MIT
DEAE-DEXTRAN
.44
2.2.1.6
TRANSFEKTION
DURCH
ELEKTROPORATION
.44
2.2.1.7
HERSTELLEN
VON
STABILEN
ZELLINIEN
.44
2.2.2
DNA-METHODEN
.
45
2.2.2.1
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
45
2.2.2.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
45
2.2.2.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN.46
2.2.2.4
PLASMID
DNA
MINI-PRAEPARATION
.46
2.2.2.5
PLASMID-DNA
MAXI-PRAEPARATION
.
46
2.2.3
KLONIERUNGSTECHNIKEN.
47
2.2.3.1
SCHNEIDEN
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
47
2.2.3.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
47
2.2.3.3
AUFFIILLEN
VON
5
'-UEBERHAENGEN
.
47
2.2.3.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN.
48
2.2.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
BAKTERIEN
.
48
2.2.4.1
CHEMISCH
KOMPETENTE
E.
COLI
BAKTERIEN
.
48
2.2.4.2
ELEKTROKOMPETENTE
E.
COLI
BAKTERIEN
.
48
2.2.5
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.49
2.2.5.1
TRANSFORMATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
BAKTERIEN:
.
49
2.2.5.2
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION:
.49
2.2.6
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(
"
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
"
,
PCR)
.49
2.2.7
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
50
2.2.7.1
MIT
33
P
MARKIERTEN
DIDESOXY-NTPS:
.
50
2.2.7.2
MIT
DEM
VISTRA
DNA
SEQUENZIERET
725
.
50
2.2.8
PROTEIN-METHODEN
.
51
6
2.2.8.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
NACH
LOWRY
.
51
2.2.8.2
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
(SDS-PAGE).
51
2.2.83
COOMASSIE-BRILLIANT-BLAU-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
NACH
SDS-PAGE
.
52
2.2.8.4
IMMUNOBLOT-ANALYSE
VON
PROTEINEN
(
"
WESTERN-BLOT
"
)
.
52
2.2.8.5
PRAEPARATION
VON
ZYTOPLASMATISCHEN
UND
NUKLEAEREN
EXTRAKTEN
.
53
2.2.8.6
PRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
FUSIONSPROTEINEN
.53
2.2.8.7
PRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
HISTIDIN-FUSIONSPROTEINEN
UNTER
DENATURIENDEN
BEDINGUNGEN.
54
2.2.8.8
ANALYSE
VON
PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN
MIT
HILFE
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
.
55
2.2.8.9
IMMUNOFLUORESZENZFARBUNG
INTRAZELLULAERER
PROTEINE
.
56
2.2.8.10
IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
IN
VITRO
TRANSLATIERTEM
TRIPOE
.
57
2.2.9
RNA
.
58
2.2.9.1
PRAEPARATION
VON
POLYA
+
-RNA
AUS
ZELLEN
.
58
2.2.9.2
HERSTELLUNG
VON
CDNA
AUS
POLYA
+
-RNA
.
59
2.2.10
HEFEMETHODEN
.
59
2.2.10.1
HEFETRANSFORMATION
MIT
HILFE
VON
LITHIUMAZETAT
.
59
2.2.10.2
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
.
60
2.2.10.3
GESAMTPROTEINEXTRAKTE
AUS
HEFE
.
61
2.2.10.4
ISOLIEREN
EINES
GENBANKPLASMIDS
.
62
2.2.11
MESSUNG
DER
FIREFLY
UND
RENILLALUZIFERASEAKTIVITAET
.
62
3
ERGEBNISSE
.
64
3.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
VERWENDETEN
GLUKOKORIKOIDREZEPTORMUTANTEN
HINSICHTLICH
IHRER
TRANSAKTIVIERUNGS
UND
REPRESSIONSEIGENSCHAFTEN.
64
3.2
FUNKTIONELLE
EXPRESSION
DES
GLUKOKORTIKOIDREZEPTORS
IN
HEFE
.
69
3.3
DIE
GLUKOKORTIKOIDREZEPTORMUTANTE
GR
MH12A
AF-I
IST
EINE
GEEIGNETE
MUTANTE
FUER
DIE
SUCHE
NACH
NEUEN
PARTNERPROTEINEN
DES
GR,
DIE
AN
DER
REPRESSION
BETEILIGT
SIND
.
70
3.4
DURCHFUEHRUNG
EINES
TWO-HYBRID
SCREENS
ZUR
IDENTIFIKATION
NEUER
PARTNERPROTEINE
DES
GR,
DIE
AN
DER
TRANSREPRESSION
BETEILIGT
SIND
.
73
3.4.1
GENBANK
UND
HEFETRANSFORMATION
.
73
3.4.2
TEST
DES
ZWEITEN
REPORTERS
LACZ
.
75
3.4.3
ISOLIERUNG
DES
GENBANKPLASMIDS
UND
RETRANSFORMATION
.
75
3.5
INTERAKTION
DER
TWO-HYBRID
ISOLATE
MIT
EINER
GR
MUTANTE,
DIE
AP-1
NICHT
MEHR
REPRIMIEREN
KANN
.
80
7
3.6
TRIPOE
IST
EIN
LIM-DOMAENENPROTEIN
.
83
3.7
DIE
TRIP6-CDNA
TRITT
IN
VERSCHIEDENEN
SPLEISSFORMEN
AUF.
.
84
3.8
ANTISENSE-TRIP6-RNA
ERHOEHT
DAS
TRANSAKTIVIERUNGSPOTENTIAL
UND
ERNIEDRIGT
DAS
TRANSREPRESSIONSPOTENTIAL
DES
GR
.
86
3.9
HERSTELLUNG
EINES
ANTISERUMS
GEGEN
TRIPOE
.
89
3.10
TRIPOE
IST
EIN
NUKLEAERES
PROTEIN
.
92
3.11
TRIPOE
INTERAGIERT
MIT
GR
IN
VITRO
.
95
3.12
TRIPOE
INTERAGIERT
MIT
DER
AP-1
KOMPONENTE
CFOS
IN
EINEM
GST-FUSIONSPROTEIN-INTERAKTIONSTEST
.
97
3.13
TRIPOE
INTERAGIERT
AUCH
MIT
EINER
KOMPONENTE
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS
NF
K
B
(RELA,
POE5)
IN
EINEM
GST-FUSIONSPROTEIN-INTERAKTIONSTEST
.
98
3.14
TRIPOE
HAT
TRANSKRIPTIONELLE
REPRESSORFUNKTION
.
99
3.14.1
DER
REPRESSIONSEFFEKT
IST
ABHAENGIG
VON
DER
EINGESETZTEN
DNA-MENGE
UND
DER
ANWESENHEIT
VON
GAL4-BINDESTELLEN
IM
PROMOTOR
.
102
3.14.2
TRIPOE
BESITZT
MINDESTENS
ZWEI
UNABHAENGIGE
REPRESSIONSDOMAENEN
.
104
3.15
HERSTELLEN
EINER
ZELLINIE
MIT
REDUZIERTEN
TRIPOE
PROTEINMENGEN
.
109
4
DISKUSSION
.
112
4.1
GR
MH
I
2
AAF-I
IST
EINE
GEEIGNETE
MUTANTE
FUER
DEN
EINSATZ
IM
TWO-HYBRID
SCREEN
.
113
4.2
NEUE
INTERAKTIONSPARTNER
DES
GR
.
114
4.3
TRIPOE
IST
EIN
NUKLEAERES
PROTEIN
UND
TRITT
IN
VERSCHIEDENEN
SPLEISSFORMEN
AUF
.
1
LOE
4.4
TRIPOE
IST
EIN
KOFAKTOR
DES
GR
UND
IST
AN
DER
TRANSAKTIVIERUNGS
UND
AN
DER
TRANSREPRESSIONSFUNKTION
BETEILIGT
.
117
4.5
FUEHRT
DIE
INTERAKTION
VON
TRIPOE
MIT
GR
UND
AP-1
(BZW.
NF
K
B)
ZUR
AUSBILDUNG
EINES
TERNAEREN
KOMPLEXES?
.
119
4.OE
TRIPOE
HAT
TRANSKRIPTIONELLE
REPRESSORFUNKTION
.
121
4.7
MODELL:
TRIPOE
BRINGT
SEINE
TRANSKRIPTIONELLE
REPRESSORFUNKTION
DURCH
AUSBILDUNG
EINES
TERNAEREN
KOMPLEXES
AN
AP-1
.
124
4.8
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG.
125
5
LITERATUR.
126
8 |
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