Komponenten des Cytoskeletts der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii: molekulare Analyse zweier Myosine und eines neuen Mikrotubuli-assoziierten Proteins
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2001
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KOMPONENTEN DES CYTOSKELETTS
DER EINZELLIGEN GRUENALGE CHLAMYDOMONAS REINHARDTN:
MOLEKULARE ANALYSE ZWEIER MYOSINE
UND EINES NEUEN MIKROTUBULI-ASSOZIIERTEN PROTEINS
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III
- BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN - DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
FRANK PFANNENSCHMID
AUS REINHARTSHOFEN
REGENSBURG, MAI 2001
IMAGE 2
INHALT I
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN .T. 12
2.1 MATERIAL 12
2.1.1 ORGANISMEN, PHAGEN UND PLASMIDE 12
2.1.2 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 15
2.1.3 MATERIAL, CHEMIKALIEN UND ENZYME 19
2.1.4 MEDIEN 22
2.1.5 PUFFER UND LOESUNGEN 23
2.2 METHODEN 29
2.2.1 KULTIVIERUNG VON ORGANISMEN 29
2.2.1.1 KULTIVIERUNG VON C. REINHARDTII 29
2.2.1.2 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA COLI 29
2.2.2 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 30
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI MIT KOMMERZIELL
ERHAELTLICHEN KITS .... 30
2.2.2.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS DEM PHAGEN A.EMBL3 30
2.2.2.3 ISOLIERUNG VON RNA AUS C. REINHARDTII 31
2.2.2.3.1 GESAMT-RNA-PRAEPARATIONEN 31
2.2.2.3.2 MRNA-PRAEPARATIONEN 32
2.2.3 GELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 32
2.2.3.1 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNA 32
2.2.3.2 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE-GELEN MIT KOMMERZIELL
ERHAETLICHEN KITS 33
2.2.3.3 AUFTRENNUNG VON RNA IN DENATURIERENDEN AGAROSEGELEN 33
2.2.4 NUKLEINSAEURE-TRANSFERTECHNIKEN 33
2.2.4.1 NORTHERN-TRANSFCR VON RNA 33
2.2.4.2 SOUTHERN-TRANSKR VON DNA 34
2.2.4.3 MARKIERUNG VON DNA-SONDEN DURCH RANDOM PRIMED LABELING 35
2.2.4.4 VORHYBRIDISIERUNG, HYBRIDISIERUNG UND WASCHEN DER MEMBRANEN 35
2.2.4.4.1 MEMBRANEN MIT GEBUNDENER RNA 35
2.2.4.4.2 MEMBRANEN MIT GEBUNDENER DNA 36
2.2.4.5 AUTORADIOGRAPHIE 37
2.2.5 PCR-TECHNIKEN: AMPLIFIKATION VON DNA 37
2.2.6 ENZYNIATISCHE SPALTUNG VON NUKLEINSAEUREN 38
IMAGE 3
INHALT
2.2.7 KLONIERUNGEN 39
2.2.7.1 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT ALKALISCHER
PHOSPHATASE 39
2.2.7.2 BEHANDLUNG VON PCR-FRAGMENTEN MIT T4-DNA-POLYMERASE UND T4-
POLYNUKLEOTIDKINASE 39
2.2.7.3 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 40
2.2.8 TRANSFORMATION VON E. COLI UND TRANSFORMANTENSELEKTION 40
2.2.9 TRANSFORMATION VON C. REINHARDTII 41
2.2.9.1 TRANSFORMATION MIT GLASS BEADS 41
2.2.9.2 TRANSFORMANTENSELEKTION 41
2.2.9.3 PHAENOTYPISCHE ANALYSE VON TRANSFORMANTEN 41
2.2.9.4 TRANSFORMANTENANALYSE AUF MOLEKULARER EBENE 42
2.2.10 DNA-SEQUENZANALYSE 42
2.2.10.1 SEQUENZGCLELEKTROPHORESC 42
2.2.10.2 AUTOMATISCHE DNA-SEQUENZANALYSE 42
2.2.11 EXPRESSION VON PROTEINEN IN E. COLI 43
2.2.11.1 EXPRESSIONSTEST 44
2.2.11.2 ANZUCHT UND INDUKTION 44
2.2.11.3 ZELLAUFSCHLUSS UND REINIGUNG UEBER EINE NI-NTA-SAEULE 44
2.2.12 ANTIKOERPER-GEWINNUNG UND AFFINITAETS-REINIGUNG 45
2.2.12.1 POLYKLONALE ANTISEREN IN KANINCHEN 45
2.2.12.2 HERSTELLUNG EINES ANTI-PEPTID-ANTIKOERPERS 45
2.2.12.3 AFFINITAETSREINIGUNG 46
2.2.13 GEWINNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS C. REINHARDTII 47
2.2.14 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION : 48
2.2.15 GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 48
2.2.16 PROTEINNACHWEIS: JFESFER/J-TRANSFER 48
2.2.16.1 TRANSFER AUFGETRENNTER PROTEINE AUF NYLON-MEMBRANEN 48
2.2.16.2 IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN 49
2.2.17 IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE 50
2.2.17.1 IF-MIKROSKOPIC VON C. REINHARDTII-ZEWEN 50
2.2.17.2 IF-MIKROSKOPIE VON HUMANEN ZELLEN 51
2.2.18 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 51
2.2.18.1 FIXIERUNG DER ALGEN 51
INHALT [»
2.2.18.2 GEFRIERSCHNITT-METHODE (CIYO SECTIONING) 52
2.2.18.3 LOWICRYL-EINBETTUNG 52
2.2.18.4 ELEKTRONENMIKROSKOPIE ISOLIERTER CYTOSKELETTE 54
3 ERGEBNISSE 55
3.1 MYOSIN-PROTEINE VON C. REINHARDTII 55
3.1.1 MYOSIN-GENE IM CHLAMYDOMONAS-GENOM 56
3.1.2 DAS C. REINHARDTII MYOL-GEN 58
3.1.2.1 STRATEGIE DER SEQUENZANALYSE 58
3.1.2.2 GENOMISCHE SEQUENZ VON MYO1 59
3.1.2.3 FESTLEGUNG DER EXON-INTRON-STRUKTUR DES MYOL-GENS 61
3.1.2.4 ABGELEITETE PRIMAERSTRUKTUR VON MYO1 63
3.1.3 MYO1-SPEZIFISCHE ANTISEREN 65
3.1.3.1 MOTORDOMAENEN-ANTIKOERPER 65
3.1.3.2 UEBEREXPRESSION VON C-TERMINALEN PEPTIDEN 66
3.1.4 ANTI-PEPTID-ANTIKOERPER UND AFFINITAETSREINIGUNG 67
3.1.5 EXPRESSION DES MYOL-GCNS IM ZELLZYKLUS 70
3.1.6 MYO1-KONZENTRATION WAEHREND DES ZELLZYKLUS VON C. REINHARDTII 72
3.1.7 LOKALISIERUNG VON MYO1 MITTELS INDIREKTER IMMUNFLUORESZENZ 73
3.1.8 ANALYSE DES MYO2-GENS 75
3.1.8.1 SUBKLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES MYO2-IOCNS 75
3.1.8.2 VORLAEUFIGE CHARAKTERISIERUNG DES MYO2-GENS 77
3.2 D1P13, EIN NEUES MIKROTUBULI-ASSOZIIERTES PROTEIN 79
3.2.1 SEQUENZ DES GENS D1P13 80
3.2.2 ABGELEITETE SEQUENZ DES PROTEINS DIPI3 .,. 82
3.2.3 HOMOLOGE PROTEINE BEI ANDEREN EUKARYONTEN 82
3.2.4 HERSTELLUNG EINES SPEZIFISCHEN ANTI-DIP13-ANTIKOERPERS 84
3.2.5 D//VI-EXPRESSION IM ZELLZYKLUS 85
3.2.6 IMMUNLOKALISIERUNG VON DIP13 IN C. REINHARDTII-ZEWEN 87
3.2.7 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 88
3.2.8 HEMMUNG DER D/P/3-EXPRESSION DURCH ANTISENSE-RNA 89
3.2.9 SCREENING EINER C. REINHARDTII BAC-BIBLIOTHEK ZUR KARTIERUNG VON
DIPI3 92
3.2.10 DAS DLP13-HOMOLOGE PROTEIN BEI VOLVOX CARTERI 93
3.2.11 LOKALISATION VON NA14 IN MENSCHLICHEN ZELLEN 95
IMAGE 4
INHALT IV
4 DISKUSSION 98
4.1 MYOSINE 99
4.1.1 ANZAHL DER MYOSINGENE IM C. REINHARDTUE-GENOM 99
4.1.2 SEQUENZAUSWERTUNG VON MYO1 UND MYO2 100
4.1.3 PHYLOGENETISCHE KLASSIFIZIERUNG DER PROTEINE MY01 UND MY02 103
4.1.4 MY01-SPEZIFISCHES POLYKLONALES ANTISERUM 106
4.1.5 DIE ROLLE VON MYO1 WAEHREND DES ZELLZYKLUS 107
4.1.6 MYOSINE IN FLAGELLEN VON C. REINHARDTIN 108
4.1.7 FUNKTIONEN VON PFLANZEN-MYOSINEN 110
4.1.8 AUSBLICK 112
4.2DIP13 113
4.2.1 TRANSKRIPTE UND CODON-AUSWAHL BEIM DIP13-GEN 113
4.2.2 LOKALISATION VON D1P13 117
4.2.3 DIP13: EIN NEUES MAP? 119
4.2.4 FUNKTION VON D1P13 119
4.2.5 D1P13 - HOMOLOGE IN ANDEREN EUKARYONTEN 123
4.2.6 AUSBLICK , 124
5 ZUSAMMENFASSUNG . 126
6 APPENDIX 128
7 LITERATUR 137
|
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