Untersuchungen zu der Rolle des Integrin alpha 3 beta 1 bei der Regulation der Zellmigration: Nachweis eines indirekten transdominant-negativen Effektes auf die Zellwanderung
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
V
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
ALLGEMEINE
EINFUEHRUNG.
1
1.2.
DIE
INTEGRINE.
3
1.2.1.
DIE
BEDEUTUNG
DER
INTEGRINE
BEI
BIOLOGISCHEN
PROZESSEN
.
3
1.2.2.
DIE
INTEGRIN-ISOFORMEN
UND
IHRE
LIGANDEN-SPEZIFITAET
-
LAMININE,
FIBRONEKTIN
UND
KOLLAGENE
ALS
WICHTIGE
LIGANDEN
FUER
INTEGRINE
.
4
1.2.3.FORSCHUNGSSTAND
UEBER
DIE
SPEZIFISCHEN
FUNKTIONEN
DER
A3SSL,
AOESSL
UND
A6SS4
INTEGRINE
.
6
13.
DIE
INTEGRIN-VERMITTELTE
ZELLMIGRATION.
9
1.4.
DIE
INTEGRIN-SPEZIFISCHE
BILDUNG
FOKALER
ADHAESIONSKOMPIEXE.
_
11
13.
ARBEITSHYPOTHESE
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT.
_
.
13
2.
MATERIAL
15
2.1.
REAGENZIEN.
15
2.2.
GERAETE.
_
15
23.
SONSTIGE
MATERIALIEN.
16
2.4.
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR.
17
23.
LOESUNGEN
_
.
_
.
_
.
_
17
2.5.1.
PUFFER.
17
2.5.2.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
NACH
LAEMMLI
(1970)
.
18
2.53.
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
.
18
23.4.
SILBERFARBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
.
19
23.5.
IMMUNOBLOT
VON
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN.
.
19
23.6.
CHLORONAPHTOLFARBUNG.
20
23.7.
FLUORESZENZMIKROSKOPIE.
20
2.5.8.
FIXIERMITTEL
.
20
2.6.
VERWENDETE
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
21
2.6.1.
PRIMAERE
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
.
21
2.6.2.
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
21
3.
METHODEN
22
3.1.
KULTUR
VON
A431,
HT1080,
L132
UND
WI26
ZELLEN
_
22
3.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MIGRATION
DER
ZELLEN.
_
.
23
3.2.1.
VORUNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINSATZ
VERSCHIEDENER
BECHICHTUNGEN
UND
MATERIALIEN.
23
3.23.
AUSSAAT
VON
ZELLEN
RUNDEN
DECKGLAESCHEN
AUS
GLAS
.
23
3.23.
TESTUNG
VON
PLASTIKDECKGLAESCHEN
FUER
DIE
MIGRATION
.
24
33.4.
VERWENDUNG
VON
LABTEK-OBJEKTTRAEGEM
AUS
PLASTIK
MIT
8
KAMMERN.
24
333.
QUANTITATIVE
MIGRATIONSVERSUCHE
.
24
3.2.5.1.
DIE
MIGRATIONSVERSUCHE
.
24
WIMMGLM
_
UE
3.2.5.2.
AUSWERTUNG
DER
MIGRATIONSGESCHWINDIGKEIT.
26
3.2.6.
QUALITATIVE
MIGRATIONSVERSUCHE
(MORPHOLOGIE)
.
28
3.2.6.1.
DARSTELLUNG
SUBZELLULAERER
STRUKTUREN
DURCH
IMMUNCYTOCHEMISCHE
METHODIK
.
28
3.2.6.2.
PROTOKOLL
DER
INDIREKTEN
IMMUNFLUORESZENZFARBUNG
.
29
3.2.7.
QUALITATIVE
UND
QUANTITATIVE
MIGRATIONSVERSUCHE
NACH
STIMULATION
MIT
INTEGRIN-REZEPTOR-BINDENDEN
ANTIKOERPERN
.
30
3.2.7.I.
MIGRATIONSASSAYS
MIT
ANTIKOERPER-STIMULATION
DER
ZELLEN.
30
3.2.7.2.
IMMUNFLUORESZENZ-UNTERSUCHUNGEN
NACH
ANTIKOERPER-STIMULATION
.
31
3.2.8.
MIKROSKOPISCHE
AUSWERTUNG
DER
IMMUNFLUORESZENZPRAEPARATE.
31
3.2.8.1.
FLUORESZENZMIKROSKOP
.
31
3.2.8.2.
VERIFIZIERUNG
SUBZELLULAERER
STRUKTUREN
MIT
EINEM
LSM
.
31
3.2.9.
LYSE
VON
ZELLEN
MIT
TRITON
X-100
.
32
3.2.10.
MIKROPROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
32
3.2.11.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
ZUR
AUFTRENNUNG
UND
ZUM
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
.
33
3.2.11.1.
SDS-PAGE
NACH
LAEMMLI
.
33
3.2.11.2.
SILBERFARBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
.
34
3.2.12.
IMMUNOBLOT
.
34
3.2.12.1.
WET-TRANSFER-ELEKTROBLOT
.
34
3.2.12.2.
PONCEAUFAERBUNG
DER
TRANSFERIERTEN
PROTEINE
.
35
3.2.12.3.
IMMUN-LUMINESZENZ-NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AM
BLOT
.
35
3.2.12.4.
CHLORONAPHTOLFAERBUNG.
36
3.2.13.
STATISTISCHE
AUSWERTUNG.
.
36
4.
ERGEBNISSE
37
4.1.
BESCHICHTUNGS
UND
MATERIALVERSUCHE
FUER
DEN
MIGRATIONSASSAY
_
_
37
4.2.
ERMITTLUNG
DER
OPTIMALEN
ZELLZAHLEN
FUER
MIGRATIONSASSAY
UND
IMMUNFLUORESZENZ.39
4.3.
ERMITTLUNG
GEEIGNETER
ZELLLINIEN
FUER
DIE
FRAGESTELLUNG
DIESER
ARBEIT.
_
41
4.4.
VERGLEICHENDE
MIGRATIONSASSAYS
VON
A431,
HT1080
UND
L132
AUF
DEN
SUBSTRATEN
HFN,
KOLL
IV
UND
LAML.
_
.
_
.
.
43
4.5.
MIGRATIONSVERSUCHE
IN
ANWESENHEIT
DES
X3-INTEGRIN-BINDENDEN
ANTIKOERPERS
P1B5.
.
46
4AE1.
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
KONZENTRATION
DES
ANTIKOERPERS
P1B5
BEI
ANWENDUNG
IN
DEN
MIGRATIONSASSAYS.
47
4.5.2.
DARSTELLUNG
DER
MIGRATIONSASSAYS
VON
A431
UND
HT1080
BEI
INKUBATION
MIT
P1B5
.
49
4.5.3.
VERGLEICH
DER
ERGEBNISSE
VON
A431
UND
HT1080
ZELLEN
MIT
MIGRATIONSVERSUCHEN
VON
WI26
FIBROBLASTEN.
51
4.6.
MIGRATIONSVERSUCHE
IN
ANWESENHEIT
DES
INTEGRIN
A6-BINDENDEN
ANTIKOERPERS
GOH3.
.
.
52
4.6.1.
ANWENDUNG
DES
ANTIKOERPERS
BEI
A431
ZELLEN
.
52
4.6.2.
TITRATION
DES
ANTIKOERPERS
GOH3
AN
A43
1
ZELLEN
IN
MIGRATIONSASSAYS
AUF
LAML
UND
HFN
.
53
4.7.
ERGEBNISSE
DER
MORPHOLOGISCHEN
UNTERSUCHUNGEN.
55
4.7.1.
ERLAEUTERUNGEN.
.
55
INHALTSVERZEICHNIS
_
VH
4.7.2.
VORVERSUCHE
.
56
4.7.3.
STIMULATIONSVERSUCHE
MIT
DEM
INTEGRIN
A3-BINDENDEN
ANTIKOERPER
P1B5
.
56
4.7.3.1.
STIMULATION
VON
HT1080
ZELLEN
MIT
P1B5
.
56
4.7.3.2.
INKUBATION
VON
A431
ZELLEN
MIT
P1B5
.
58
4.7.3.3.
TIME-COURSE
EXPERIMENT
DES
EFFEKTES
VON
P1B5
AUF
A43
1
ZELLEN.
61
4.7.3.4.
EFFEKT
DES
P1B5
AUF
DIE
VERTEILUNG
DER
INTEGRIN
A3-UNTEREINHEIT
IN
A43
1
ZELLEN
.
62
4.7.3.5.
INKUBATION
VON
WI26
ZELLEN
MIT
P1B5
ALS
KONTROLLE
ZU
HT1080
UND
A43
1
.
63
4.7.4.
STIMULATIONSEXPERIMENTE
MIT
DEM
ANTI-A6-INTEGRIN
UNTEREINHEIT
BINDENDEN
ANTIKOERPER
GOH3
.
64
4.7.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
VINCULIN-EXPRESSION
NACH
P1B5
STIMULATION
.
65
4.8.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SIGNALTRANSDUKTION
_
_
.66
4.8.1.
BETEILIGUNG
DER
PKC
AM
EFFEKT
DES
P1B5
ANTIKOERPERS
.
66
4.8.2.
BETEILIGUNG
DER
KLEINEN
GTPASE
RHO
AN
DEN
EFFEKTEN
VON
P1B5
.
67
S.
DISKUSSION
69
5.1.
ZIELE
DIESER
ARBEIT.
_
.69
5.2.
AUSWAHL
DER
MATERIALIEN
UND
METHODEN
UND
ERMITTLUNG
KRITISCHER
FAKTOREN.
70
53.
DIE
MIGRATIONSGESCHWINDIGKEIT
IST
ABHAENGIG
VOM
EXPRESSIONSVERHAELTNIS
DER
INTEGRINE
A3SSL
UND
A6SS4.
_
.
72
5.4.
DIE
ROLLE
DES
A3SSL
INTEGRINS
IN
DER
REGULATION
DER
ZELLMIGRATION
IST
ZELLTYP-SPEZIFISCH
UND
ABHAENGIG
VOM
KONTEXT
DER
ZELLE.
_
75
5.5.
ROLLE
DER
PKC
BEI
DEN
MORPHOLOGISCHEN
VERAENDERUNGEN
_
.
82
5.6.
HINWEISE
FUER
EINE
BETEILIGUNG
VON
A3SSL
BEI
DER
REGULATION
KLEINER
GTPASEN
DER
RHO-FAMILIE
_
.
_
.
_
83
5.7.
MORPHOLOGISCHE
VERAENDERUNGEN
SIND
KEINE
FOLGE
REDUZIERTER
EXPRESSION
VON
KOMPONENTEN
DER
ZELL-ADHAESIONSKOMPLEXE.
_
85
5.8.
FAZIT.86
5.9.
BEDEUTUNG
DER
ERGEBNISSE
FUER
DIE
MEDIZIN.
_
.
_
88
5.10.
AUSBLICK.
89
6.
ZUSAMMENFASSUNG
90
7.
LITERATURVERZEICHNIS
91
8.
LEBENSLAUF
98-99 |
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