Rekombinantes humanes BMP-2 aus Escherichia coli: Strategien zur Expression und Funktionalisierung
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. SYSTEME REKOMBINANTER PROTEINPRODUKTION 1
1.2. REKOMBINANTE PROTEINPRODUKTION IN PROKARYOTEN 3
1.3. STRATEGIEN ZUR OPTIMIERUNG REKOMBINANTER PROTEINPRODUKTION 7
1.4. BMP-2 ALS MITGLIED DER TGF-SS-SUPERFAMILIE 11
1.5. REKOMBINANTE PRODUKTION VON MITGLIEDERN DER TGF-SS-SUPERFAMILIE 12
1.6. BEDEUTUNG VON MITGLIEDERN DER TGF-SS-SUPERFAMILIE 13
1.7. AUFGABENSTELLUNG 15
2. MATERIAL UND METHODEN 16
2.1. ESCHERICHIA COLI STAEMME 16
2.2. PLASMIDE 17
2.3. OLIGONUKLEOTIDE 18
2.4. ALLGEMEINE MIKROBIOLOGISCHE ARBEITSTECHNIKEN 19
2.4.1. KULTIVIERUNG 19
2.4.2. STAMMHALTUNG 20
2.4.3. BESTIMMUNG DER BIOMASSEKONZENTRATION 20
2.4.4. ZELLEMTE 20
2.5. ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSTECHNIKEN 21
2.5.1. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 21
2.5.2. LINEARE AGAROSEGELELEKTROPHORESE 21
2.5.3. VEKTORKONSTRUKTION 21
2.5.4. POLYMERASEKETTENREAKTION 23
2.6. ALLGEMEINE ARBEITSTECHNIKEN DER REKOMBINANTEN PROTEINEXPRESSION 23
2.6.1. STANDARDKULTIVIERUNGEN 23
2.6.2. ZELLAUFSCHLUSSMETHODEN 24
2.6.2.1. OSMOTISCHER SCHOCK 24
2.6.2.2. ULTRASCHALLAUFSCHLUSS 25
2.6.3. PROTEINBESTIMMUNG 25
2.6.4. POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 25
2.6.5. COOMASSIE-BRILLIANTBLAU-FAERBUNG 27
2.6.6. MEMBRANTRANSFER (WESTERN BLOT) 28
2.6.7. PONCEAU-S-FAERBUNG 28
2.6.8. SPEZIFISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN 28
2.6.8.1. STREPTAGH-NACHWEIS 29
2.6.8.2. BMP-2-NACHWEIS 29
2.6.8.3. HIS6-TAG-NACHWEIS 29
2.6.8.4. MBP-NACHWEIS 30
2.6.8.5. THIOREDOXIN-NACHWEIS 30
2.7. SPEZIELLE METHODEN IN ASSOZIATION MIT DEN
FUNKTIONALISIERUNGSSTRATEGIEN
VON MBP-BMP-2 30
2.7.1. KULTIVIERUNGEN UNTER ZUGABE
VON FOLDINGPROMOTING AGENTS 30
2.7.2. FERMENTATION 32
2.7.3. ZELLAUFSCHLUSS 33
2.7.4. PROTEINREINIGUNG 33
2.7.5. ENZYMATISCHE ABSPALTUNG DES FUSIONSPARTNERS 33
2.7.6. SPEZIFISCHER NACHWEIS DER FUNKTIONELLEN FALTUNG VON BMP-2 34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.8. ERSTELLUNG VON EXPRESSIONSPROFILEN 34
2.8.1. ISOLIERUNG VON TOTAL RNA 34
2.8.2. CHEMILUMINESZENZBASIERTE METHODE 34
2.8.3. RADIOAKTIVITAETSBASIERTE METHODE 35
2.8.4. DATENANALYSE 36
2.8.5. WISSENSBASIERTE BEWERTUNG DER EXPRESSIONSVERHAELTNISSE 36
3. ERGEBNISSE 37
3.1. STRATEGIEN ZUR RHBMP-2 SYNTHESE IN
E.COLI 37
3.1.1. PERIPLASMATISCHE PRODUKTLOKALISATION 37
3.1.2. TRANSLATIONSOPTIMIERUNG 40
3.1.3. F ALTUNGSOPTIMIERUNG 42
3.1.4. DIREKTE LOESLICHKEITSOPTIMIERUNG 44
3.1.4.1. KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN 44
3.1.4.2. BMP-2-FUSIONSPROTEINE 45
3.2. OPTIMIERUNG DES WIRTS-VEKTOR-SYSTEMS FUER DIE BILDUNG VON
MBP-BMP-2-FUSIONSPROTEIN 49
3.2.1. KOMPARTIMENTVERGLEICH 49
3.2.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR MINIMIERUNG UNSPEZIFISCHER PROTEOLYSE 50
3.2.3. EINFLUSS DES WIRTSSTAMMES AUF VERSCHIEDENE
PRODUKTBILDUNGSKRITERIEN 53
3.2.4. CODON USAGE 55
3.2.5. GENTECHNISCHE OPTIMIERUNG DES FUSIONSBEREICHS 57
3.3. STRATEGIEN ZUR FUNKTIONALISIERUNG VON MBP-BMP-2-FUSIONSPROTEIN 59
3.3.1. NACHWEISMETHODE FUER FUNKTIONELLES BMP-2 59
3.3.2. VARIATION DER KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN 60
3.3.3. EXPRESSIONSPROFILE ZUR CHARAKTERISIERUNG VON
PRODUKTBILDUNGSZUSTAENDEN 62
3.3.3.1. ENTWICKLUNG EINES PROTOKOLLS ZUR CHEMILUMINESZENZDETEKTION 63
3.3.3.2. VALIDIERUNGSEXPERIMENTE 64
3.3.3.3. ANWENDUNG AUF PRODUKTBILDUNGSZUSTAENDE 69
4. DISKUSSION
72
4.1. STRATEGIEN ZUR LOESLICHEN RHBMP-2 SYNTHESE IN
E, COLI 71
4.2. STRATEGIEN ZUR FUNKTIONALISIERUNG 77
4.3. MOEGLICHE URSACHEN FUER EINE LOESLICHE, ABER NICHT FUNKTIONELLE
SYNTHESE VON
RHBMP-2 UNTER BERUECKSICHTIGUNG DER ERGEBNISSE AUS DEN
EXPRESSIONSPROFILEN 87
5. ZUSAMMENFASSUNG
92
6. LITERATURVERZEICHNIS 2
ANHANG
FALTUNGSTOPOLOGIE DES NATIVEN BMP-2 DIMERS XV
FALTUNGSTOPOLOGIE DES BMP-2-BRIA ECD-KOMPLEXES XVI
SEQUENZ: HUMANES BMP-2 XVII
SEQUENZ: BMP-2 (MATURER TEIL,
CODON USAGE AN E.COLI ADAPTIERT) XVIII
SEQUENZ: MBP XIX
SEQUENZEN: LINKERREGIONEN XXI
AUSFUEHRLICHE ERGEBNISTABELLEN AUS EXPRESSIONSPROFILEN XXII |
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