Untersuchungen zur Charakterisierung eines Purinozeptors und zur Expression von Komplementfaktoren des klassischen Aktivierungsweges in humanen Praeadipozyten:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. DAS FETTGEWEBE 1
1.2. P2X-REZEPTOREN 3
1.2.1. ALLGEMEINES 3
1.2.2. STRUKTURELLE ASPEKTE VON P2X-REZEPTOREN 5
1.2.3. PHARMAKOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON P2X-REZEPTOREN 8
1.2.4. LOKALISATION VON P2X-REZEPTOREN 8
1.2.5. HINWEISE AUF EINEN P2X-REZEPTOR AUF STROMAZELLEN DES HUMANEN 9
FETTGEWEBES
1.3. DAS KOMPLEMENTSYSTEM 11
1.3.1. BEGRIFF 11
1.3.2. FUNKTIONELLE KLASSIFIZIERUNG DER KOMPLEMENTFAKTOREN 11
1.3.3. "PATHWAYS" DES KOMPLEMENTSYSTEMS 12
1.3.4. DER KLASSISCHE AKTIVIERUNGSWEG 13
1.3.5. DIE KOMPLEMENTFAKTOREN DES KLASSISCHEN AKTIVIERUNGSWEGES 14
1.3.6. FETTGEWEBE UND KOMPLEMENTSYSTEM 16
1.4. AUFGABENSTELLUNG 17
2. MATERIAL UND METHODEN 18
2.1. CHEMIKALIEN 18
2.1.1. ALLGEMEINE CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 18
2.1.2. PUFFER UND LOESUNGEN 19
2.1.3. ENZYME 20
2.1.4. ANTIKOERPER 20
2.1.5. KITS 20
2.2. BAKTERIENSTAEMME, HEFESTAEMME, ZELLEN, VEKTOREN UND OLIGONUKLEOTIDE
20
2.2.1. BAKTERIENSTAEMME UND BAKTERIENMEDIEN 20
2.2.2. HEFESTAEMME, MEDIEN UND MEDIENZUSAETZE 21
2.2.3. ZELLEN UND MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR 22
2.2.4. VEKTOREN UND OLIGONUKLEOTIDE 22
2.3. GERAETE 24
2.4. ZELLKULTUR 25
2.4.1. ISOLIERUNG VON STROMAZELLEN DES HUMANEN FETTGEWEBES 25
2.4.2. KULTIVIERUNG UND SUBKULTIVIERUNG VON STROMAZELLEN DES HUMANEN 25
FETTGEWEBES
2.4.3. UMSTELLEN AUF SERUMFREIE BEDINGUNGEN 26
2.4.4. SERUMFREIE AUFZUCHT UND DIFFERENZIERUNG PRIMAERKULTIVIERTER
HUMANER 26
PRAEADIPOZYTEN
2.5. CHARAKTERISIERUNG DER ZELLEN 26
2.5.1. ZELLEMTE FUER DIE BESTIMMUNG DER GESAMTPROTEINMENGE UND DER 27
SPEZIFISCHEN GPDH-AKTIVITAET
2.5.2. BESTIMMUNG DER GESAMTPROTEINMENGE NACH BRADFORD 27
2.5.3. BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN GPDH-AKTIVITAET 27
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/963238051
28
2.5.4. BESTIMMUNG DER AROMATASE-AKTIVITAET
2.6. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 28
2.6.1. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 28
2.6.1.1. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS STROMAZELLEN DES HUMANEN FETT- 28
GEWEBES
2.6.1.2. REINIGUNG VON POLYA+-RNA 29
2.6.1.3. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 29
2.6.1.4. ISOLIERUNG VON PLSAMID-DNA AUS HEFEN 29
2.6.1.5. GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA 30
2.6.1.6. GELELEKTROPHORETISCHE REINIGUNG VON DNA 30
2.6.2. ENZYM-KATALYSIERTE MODIFIZIERUNGEN VON DNA 31
2.6.2.1. VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 31
2.6 2.2. BEHANDLUNG VON DNA-ENDEN MIT KLENOW-POLYMERASE 31
2.6 2.3. BEHANDLUNG VON DNA-ENDEN MIT T4-DNA-POLYMERASE 31
2.6.3. KLONIERUNG VON DNA 32
2.6.3.1. PRAEPARATION VON VEKTOREN 32
2.6.3.2. KLONIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN 32
2.6 3.2.1. KLONIERUNG UEBER KOHAESIVE ENDEN 32
2.6.3.2.2. KLONIERUNG UEBER BUENDIGE ENDEN 32
2.6.3.3. LIGATION 32
2.6.3.4. TRANSFORMATION VON E. COLI 33
2.6.3.4.1. HITZESCHOCK-TRANSFORMATION VON E. COLI 33
2.6 3.4.2. TRANSFORMATION VON E. COLI DURCH ELEKTROPORATION 33
2.6.4. KONSTRUKTION DER CDNA-BAENKE 34
2.6.5. TWO-HYBRID-SCREENING 35
2.6.5.1. TRANSFORMATION VON HEFEN 35
2.65.2. SCREENING 35
2.6.5.3. GALAKTOSIDASE-ASSAY 35
2.6.6. TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN AUF FILTERMEMBRANE 36
2.6.6.1. SOUTHERN-BLOT 36
2.66.2. NORTHERN-BLOT 36
2.6.7. HERSTELLUNG DIGOXIGENIN-MARKIERTER DNA-SONDEN 36
2.6.8. HYBRIDISIERUNG TRAEGERGEBUNDENER NUKLEINSAEUREN UND DETEKTION 37
2.6.9. PCR 37
2.6.9.1. DNA ALS TEMPLATE 37
2.6.92. RT-PCR 38
2.6.9.3. SEMIQUANTITATIVE RT-PCR 38
2.6.9.3.1. ZELLYSE 38
2.6.9.3.2. REVERSE TRANSKRIPTION 39
2.6.9 3.3. PCR UND DETEKTION 39
2.6.10. SEQUENZIERUNG VON DOPPELSTRANG-DNA 39
2.7. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 39
2.7.1. PRAEPARATION VON PROTEIN-EXTRAKTEN AUS HEFEN 39
2.7.2. SDS-PAGE NACH LAEMMLI 40
2.7.3. SILBERFAERBUNG VON GELEN 40
2.7.4. WESTERN-BLOTTING 40
2.8. IMMUNOLOGISCHE METHODEN 41
2.8.1. IMMUNDETEKTION VON KOMPLEMENTFAKTOREN 41
2.8.2. IMMUNDETEKTION VON FUSIONSPROTEINEN IN HEFEN 41
II
3. ERGEBNISSE 42
3.1. DER PURINOZEPTOR AUF STROMAZELLEN DES HUMANEN FETTGEWEBES 42
3.1.1. KLONIERUNG DES BAIT-KONSTRUKTES FUER DEN TWO-HYBRID-ASSAY 42
3.1.2. KONSTRUKTION DER CDNA-BANKEN 47
3.1.2.1. CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN ZELLPRAEPARATIONEN 47
3.1.2.2. CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN POLYA
+-RNA 48
3.1.2.3. KONSTRUKTION DER CDNA-BANKEN 49
3.1.2.4. CHARAKTERISIERUNG DER CDNA-BANKEN 51
3.1.2.4.1. ALLGEMEINES 51
3.1.2.4.2. ANALYSE DER INSERTGROESSEN 52
3.1.2.4.3. DER P2X1 -REZEPTOR IST IN DER CDNA-BANK 1 REPRAESENTIERT 54
3.1.3. TWO-HYBRID-SCREENING DER CDNA-BANK 1 55
3.1.3.1. EXPRESSION DES BAITS 56
3.1.3.2. TWO-HYBRID-ASSAYS 58
3.1.3.3. KLON K37/2 59
3.1.4. ISOLIERUNG DES FEHLENDEN P2X1-FRAGMENTES 60
3.2. KOMPLEMENTFAKTOREN DES KLASSISCHEN AKTIVIERUNGSWEGES IN HUMANEN 62
PRAEADIPOZYTEN
3.2.1. NACHWEIS DER C1S-MRNA DURCH NORTHERN-BLOT-TECHNIK 62
3.2.2. NACHWEIS WEITERER KOMPLEMENTFAKTOREN DES KLASSISCHEN 63
AKTIVIERUNGSWEGES IN DER CDNA-BANK 1
3.2.3. DIE MRNA DIESER KOMPLEMENTFAKTOREN IST NUR IN PRAEADIPOZYTEN 64
NACHWEISBAR, NICHT IN REIFEN ADIPOZYTEN
3.2.4. NACHWEIS DER TRANSLATION UND SEKRETION DER KOMPLEMENTFAKTOREN 66
C1S UND C1R IN HUMANEN PRAEADIPOZYTEN
3.2.5. VERIFIZIERUNG DER EXPRESSION VON C1S, C1 R, C2 UND C4 IN HUMANEN
68
PRAEADIPOZYTEN
3.2.6. DIFFERENZIERUNGSABHAENGIGE EXPRESSION DER NACHWEISBAREN 70
KOMPLEMENTFAKTOREN IN HUMANEN PRAEADIPOZYTEN
3.2.6.1. OPTIMIERUNG EINER RT-PCR ZUM SEMIQUANTITATIVEN NACHWEIS DER 70
KOMPLEMENTFAKTOREN
3.2.6.2. DIFFERENZIERUNGSABHAENGIGE EXPRESSION DER FAKTOREN C1S UND C1R
73
3.2.6.2.1. ERGEBNISSE DER SEMIQUANTITATIVEN RT-PCR 73
3.2.6.2.2. DIFFERENZIERUNGSABHAENGIGER NACHWEIS DER KOMPLEMENTFAKTOREN
C1S 75
UND C1R DURCH WESTERN-BLOT-TECHNIK
3.2.6.3. DIFFERENZIERUNGSABHAENGIGE EXPRESSION DER FAKTOREN C2 UND C4 76
3.2.7. EINFLUSS AEUSSERER FAKTOREN AUF DIE EXPRESSION VON C1S UND C1R 78
3.2.7.1. EINFLUSS DER INDUKTOREN CORTISOL UND IBMX AUF DIE EXPRESSION
VON 78
C1S UND C1R
3.2.7.2. EINFLUSS VON TN FA AUF DIE EXPRESSION VON C1S UND C1R 79
4. DISKUSSION 82
4.1. DER PURINOZEPTOR AUF STROMAZELLEN DES HUMANEN FETTGEWEBES 82
4.2. EXPRESSION VON KOMPLEMENTFAKTOREN DES KLASSISCHEN AKTIVIERUNGSWEGES
86
IN HUMANEN PRAEADIPOZYTEN
5. ZUSAMMENFASSUNG 92
6. LITERATURVERZEICHNIS 94
III |
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| spelling | Kramheller, Christian Verfasser aut Untersuchungen zur Charakterisierung eines Purinozeptors und zur Expression von Komplementfaktoren des klassischen Aktivierungsweges in humanen Praeadipozyten vorgelegt von Christian Kramheller Regensburg 2001 V, 102 Bl. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Universität Regensburg 2001 Komplement Immunologie (DE-588)4120589-3 gnd rswk-swf cDNS (DE-588)4212297-1 gnd rswk-swf Präadipozyt (DE-588)4667002-6 gnd rswk-swf Purinozeptor (DE-588)4176398-1 gnd rswk-swf Genbibliothek (DE-588)4236160-6 gnd rswk-swf Genexpression (DE-588)4020136-3 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Präadipozyt (DE-588)4667002-6 s Komplement Immunologie (DE-588)4120589-3 s Genexpression (DE-588)4020136-3 s DE-604 Purinozeptor (DE-588)4176398-1 s cDNS (DE-588)4212297-1 s Genbibliothek (DE-588)4236160-6 s Erscheint auch als Online-Ausgabe https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:355-opus-466 Resolving-System kostenfrei Volltext https://epub.uni-regensburg.de/9891/ Verlag kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009570615&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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