Regulierung eines kalziumempfindlichen Kaliumkanals durch Proteinkinase C:
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2001
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| Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 IONENKANAELE 1
1.2 KALIUMKANAELE 2
1.3 CA
2+-EMPFINDLICHE K+-KANAELE 4
1.4 CA
2+-EMPFINDLICHE K+-KANAELE MITTLERER LEITFAEHIGKEIT 6
1.5 REGULIERUNG CA
2+-EMPFINDLICHER K+-KANAELE DURCH PROTEINKINASEN 8
1.6 ZIELSETZUNG 9
2. MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 MATERIAL 11
2.1.1 CHEMIKALIEN 11
2.1.2 GERAETE ' 11
2.1.3 PUFFER, LOESUNGEN, MEDIEN 13
2.1.4 OLIGONUKLEOTIDE 18
2.1.5 VEKTOREN 18
2.1.6 ZELLINIEN UND BAKTERIEN 19
2.1.7 SOFTWARE 19
2.2 DNA-TECHNIKEN 20
2.2.1 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 20
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2 PLASMID-ISOLIERUNG 20
2.2.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION 21
2.2.4 PCR ZUM NACHWEIS TRANSFORMIERTER BAKTERIENKOLONIEN 22
2.2.5 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE 22
2.2.6 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 24
2.2.7 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 24
2.2.8 GELELEKTROPHORESE VON DNA 24
2.2.9 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 25
2.2.10 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 25
2.2.11 DNA-EXTRAKTION UND -PRAEZIPITATION 26
2.2.12 DNA-SEQUENZIERUNG ~~ 26
2.3 ARBEITEN AUF ZELLULAERER EBENE 26
2.3.1 LANGZEITLAGERUNG UND ROUTINEHALTUNG VON ZELLEN 27
2.3.2 AUSSAAT VON ZELLEN FUER DIE ELEKTROPHYSIOLOGIE 28
2.3.3 TRANSIENTE TRANSFEKTION 28
2.3.4 STABILE TRANSFEKTION 29
2.4 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE METHODEN 30
2.4.1 THEORIE DER PATCH-CLAMP-TECHNIK 30
2.4.2 MESSANORDNUNGEN 31
2.4.3 MESSPLATZ 32
2.4.4 PIPETTENPRAEPARATION 34
2.4.5 DATENERFASSUNG UND ANALYSE 35
2.4.6 PULSPROTOKOLLE 36
2.4.7 STATISTIK 38
3. ERGEBNISSE 39
3.1 STRUKTURANALYSE 40
3.1.1 PROTEINSEQUENZVERGLEICH UND SEQENZANALYSE 40
3.2 CHARAKTERISIERUNG DES EXPRESSIONSSYSTEMS 42
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1 HETEROLOGE EXPRESSION VON CIKL-KANAELEN 42
3.3 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON CIKL-STROEMEN 44
3.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR KALIUMSELEKTIVITAET 44
3.3.2 ABHAENGIGKEIT VON DER INTRAZELLULAEREN CA
2+-KONZENTRATION 46
3.3.3 PHARMAKOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG 47
3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHOSPHORYLIERUNG 52
3.4.1 REGULIERUNG DURCH DIE PROTEINKINASE A (PKA) 52
3.4.2 REGULIERUNG DES CIKL DURCH DIE PROTEINKINASE C (PKC) 54
3.4.3 HEMMBARKEIT ATP-INDUZIERTEN STROMS 56
3.4.4 AKTIVIERUNG DER PKC - 58
3.4.5 LANGZEITSTIMULIERUNG MIT PHORBOLESTEM 59
3.5 MUTATION DER PKC-PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN 62
3.5.1 UNTERSUCHUNG DER MUTANTEN AUF FUNKTIONALITAET 62
3.5.2 REGULIERUNG DURCH DIE PROTEINKINASE C 64
3.5.3 HEMMBARKEIT ATP-INDUZIERTEN STROMS 66
3.5.4 AKTIVIERUNG DER PKC 68
3.5.5 LANGZEITSTIMULIERUNG MIT PHORBOLESTEM 70
4. DISKUSSION 73
4.1 VERGLEICH DES KLONIERTEN CIKL MIT IKL-KANAELEN ANDERER SPEZIES 74
4.2 VERGLEICH DES KLONIERTEN CIKL MIT DEM NATIVEN CIKL 76
4.3 REGULIERUNG DER IK1 -KANAELE DURCH DIE PROTEINKINASE A 77
4.4 REGULIERUNG DER IK1-KANAELE DURCH DIE PROTEINKINASE C 79
4.5 EINFLUSS DER MUTATIONEN AUF DIE KANALAKTIVITAET 81
5. ZUSAMMENFASSUNG 84
SUMMARY 86
III
INHALTSVERZEICHNIS
6. LITERATURVERZEICHNIS 88
7. ANHANG 99
7.1 AMINOSAEURESEQUENZ DES CIKL 99
7.2 VERGLEICH DER AMINOSAEURESEQUENZ VON IKL~KANAELEN 100
7.3 ABKUERZUNGEN ^
7.4 DANKSAGUNGEN 1^3
IV |
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