Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) für den Nachweis pathogener Bakterien in Bioabfallproben:
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| Format: | Buch |
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
2 STAND DES WISSENS.2
2.1 BIOLOGISCHE ABFALLBEHANDLUNG.2
2.1.1 KOMPOSTIERUNG.2
2.1.2 VERGAERUNG.3
2.2 HYGIENISIERUNG BEI DER BIOABFALLBEHANDLUNG.4
2.3 VORKOMMEN UND RELEVANZ VON KRANKHEITSERREGERN IN BIOABFALLEN UND
KOMPOST.6
2.3.1 VORKOMMEN.6
2.3.2 RISIKO DURCH UNZUREICHENDE HYGIENISIERUNG UND WIEDERVERKEIMUNG.8
2.4 NAEHERE CHARAKTERISIERUNG DER IN DIESER ARBEIT UNTERSUCHTEN
BAKTERIENARTEN.10
2.4.1 SALMONELLA SPP.10
2.4.2 LISTERIA MONOCYTOGENES.11
2.4.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS.11
2.4.4 YERSINIA ENTEROCOLITICA.12
2.5 DETEKTION PATHOGENER MIKROORGANISMEN MIT KLASSISCHEN
METHODEN. 12
2.6 "VIABLE BUT NONCULTURABLE CELLS (VBNC)".13
2.7 HYBRIDISKRUNG VON
NUKLEINSAEUREN.
14
2.8 DIE POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR).-.------ 16
2.8.1 GRUNDPRINZIP DA" PCR.16
2.8.2 HOT-START-PCR.21
2.8.3 NESTED PCR.21
2.8.4 REVO-SE TRANSKRIPTASE-PCR.22
2.8.5 MULTIPLEX PCR.25
2.9 DETEKTION DES PCR-PRODUKTES.26
2.10 QUANTITATIVE PCR.28
2.10.1 GRUNDLAGEN.28
2.10.2 KOMPETITIVE PCR.29
2.10.3 REAL-TIM E-PCR.30
2.11 ANWENDUNGSBEREKHE DER PCR.30
2.12 EXTRAKTION BAKTERIELLER NUKLEINSAEUREN.33
2.12.1 DNA-EXTRAKTION.33
2.12.2 RNA-EXTRAKTION.34
2.13 PCR-NACHWEIS IN UMWELTPROBEN.35
2.13.1 ALLGEMEINE PROBLEMATIK.35
2.13.2 ABTRENNUNG VON HEMMSTOFFEN.35
2.13.3 ERHOEHUNG DER ANZAHL DER ZIELZELLEN DURCH ANREICHERUNG.37
2.13.4 ERHOEHUNG DER SENSITIVITAET DURCH VARIATIONEN DER PCR UND DER
PCR-PRODUKTDETEKTION.37
2.13.5 NACHWEISVERFAHREN UND DETEKTIONSGRENZEN.39
2.13.6 EXTRAKTION VON MESSENGER RNA UND RT-PCR-NACHWEIS IN UMWELT- UND
LEBENSMITTELPROBEN.40
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.14 NUCLEIC ACID SEQUENCE-BASED AMPLIFICATION SYSTEM (NASBA).41
2.14.1 GRUNDLAGEN.41
2.14.2 ANWENDUNGEN.43
3 ZIELSETZUNG. 45
3.1 METHODENENTWICKLUNG.45
3.1.1 NACHWEISVERFAHREN BERUHEND AUF DNA-EXTR;I- TION UND ANSCHLIESSENDER
PCR-REAKTION.45
3.1.2 NACHWEISVERFAHREN BERUHEND AUF RNA-EXTRAKTION ANSCHLIESSENDER
RT-PCR.46
3.2 METHODENANWENDUNG UND KRITISCHE BEURTEILUNG DER NEUENTWICKELTEN
METHODEN.46
' . .47
.47
.47
4.3 NACHWEIS DER BAKTERIENARTEN MIT KLASSISCHEN METHODEN.48
4.3.1 ISOLIERUNG VON SALMONELLA SPP.48
4.3.2 ISOLIERUNG VON LISTERIA MONOCYTOGENES.48
4.3.3 ISOLIERUNG VON YERSINIA ENTEROCOLITICA.48
4.3.4 ISOLIERUNG VON STAPHYLOCOCCUS AUREUS.49
4.3.5 IDENTIFIZIERUNG DER AUF SELEKTIVPLATTEN ISOLIERTEN KOLONIEN.49
4.4 NACHWEISMETHODE BASIEREND AUF DNA-EXTRAKTION UND PCR.50
4.4.1 ANREICHERUNGSBEDINGUNGEN.50
4.4.2 DNA-EXTRAKTION.51
4.4.3 REINIGUNG DER DNA-ROHEXTRAKTE.55
4.4.4 PCR-PROTOKOLLE.58
4.4.5 SPEZIFISCHE PCR-PRIMER UND -PROGRAMME.59
4.5 NACHWEISMETHODE BASIEREND AUF RNA-EXTRAKTION UND
RT-PCR. 63
4.5.1 ANREICHERUNGSBEDINGUNGEN.63
4.5.2 RNA-EXTRAKTION.63
4.5.3 DNA-VERDAU.66
4.5.4 RT-PCR-PROTOKOLLE.66
4.5.5 SPEZIFISCHE RT-PCR-PRIMER, NESTED PRIMER UND RT-PCR-PROGRAMME.69
4.6 NACHWEISMETHODE BASIEREND AUF RNA-EXTRAKTION UND NASBA.72
4.6.1 ANREICHERUNGSBEDINGUNGEN UND RNA-EXTRAKTION.72
4.6.2 DURCHFUEHRUNG DA- NASBA.72
4.6.3 NASBA-PRIMER.73
4.7 GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG.-.74
4.7.1 DETEKTION DE- PCR BZW. RT-PCR-PRODUKTE.74
4.7.2 DETEKTION DA- NASBA-PRODUKTE.74
5 ERGEBNISSE I (METHODENENTWICKLUNG).76
5.1 PCR-NACHWEIS NACH DNA-EXTRAKTION: METHODENAUSWAHL U. OPTIMIERUNG.76
5.1.1 WAHL GEEIGNETER PRIMERSETS FUER DIE PCR.76
5.1.2 OPTIMIERUNG DER PCR.77
5.1.3 DNA-EXTRAKTION MIT METHODE I (NACH ZHOU).78
5.1.4 DNA-EXTRAKTION MIT METHODE II (NACH MAKINO).81
5.1.5 OPTIMIERUNG DER METHODE II BEZUEGLICH SCHWANKENDEM TS-GEHALT DER
BIOABFALLPROBEN.83
5.1.6 NACHWEIS VON ABGETOETETEN ZELLEN MIT METHODE II.84
5.1.7 WAHL DER ANREICHERUNGSBEDINGUNGEN VOR DER EXTRAKTION.86
5.2 BEURTEILUNG DER NACHWEISMETHODE FUER VERSCHIEDENE BAKTERIENARTEN.88
5.2.1 FRAGESTELLUNGEN UND VORGEHENSWEISE.88
5.2.2 PCR-NACHWEIS VON SALMONELLA SPP.89
5.2.3 PCR-NACHWEIS VON LISTERIA MONOCYTOGENES.91
5.2.4 PCR-NACHWEIS VON YERSINIA ENTEROCOLITICA.93
5.2.5 PCR-NACHWEIS VON STAPHYLOCOCCUS AUREUS.95
5.2.6 ZUSAMMENFASSUNG.97
5.3 RT-PCR-NACHWEIS NACH RNA-EXTRAKTION. 98
5.3.1 WAHL GEEIGNETER PRIMERSETS FUER DIE RT-PCR.98
5.3.2 WAHL EINER GEEIGNETEN RNA-EXTRAKTIONSMETHODE.99
5.3.3 WAHL EINES GEEIGNETEN RT-PCR-SYSTEMS.99
5.3.4 RT-PCR-NACHWEIS VON LISTERIA MONOCYTOGENES.100
5.3.5 RT-PCR-NACHWEIS VON SALMONELLA TYPHIMURIUM.102
5.3.6 RT-PCR-NACHWEIS VON STAPHYLOCOCCUS AUREUS.103
5.3.7 RT-PCR-NACHWEIS VON YERSINIA ENTEROCOLITICA.104
5.3.8 ZUSAMMENFASSUNG.105
5.4 VERGLEICH NASBA/RT-PCR.106
5.5 SEMIQUANTITATIVE BESTIMMUNG DER AUSGANGSZELLKONZENTRATIONEN.107
6 ERGEBNISSE II (ANLAGENBEPROBUNG).109
6.1 NACHWEIS MIT KLASSISCHEN METHODEN.109
6.2 NACHWEIS BASIEREND AUF DNA-EXTRAKTION UND PCR.112
6.2.1 PCR-NACHWEIS VON SALMONELLA SPP. 112
6.2.2 PCR-NACHWEIS VON
LISTERIA MONOCYTOGENES.115
6.2.3 PCR-NACHWEIS VON YERSINIA ENTEROCOLITICA UND STAPHYLOCOCCUS
AUREUS.117
63 NACHWEIS BASIEREND AUF RNA-EXTRAKTION UND
RT-PCR.
118
6.3.1 RT PCR-NACHWEIS VON
SALMONELLA SPP.118
6.3.2 RT-PCR-NACHWEIS VON LISTERIA MONOCYTOGENES.119
6.3.3 RT-PCR-NACHWEIS VON YERSINIA ENTEROCOLITICA UND STAPHYLOCOCCUS
AUREUS.119
6.3.4 VERGLEICH RT-PCR/NASBA.120
6.4 ZUSAMMENFASSUNG 121
7 DISKUSSION.122
7.1 NOTWENDIGKEIT UND ANFORDERUNGEN AN EINE NEUE NACHWEISMETHODE.122
7.2 PCR-NACHWEIS BERUHEND AUF DNA-EXTRAKTION.123
7.2.1 PCR-NACHWEIS NACH DIREKTER DNA-EXTRAKTION.123
7.2.2 DNA-EXTRAKTION NACH SELEKTIVER VORANREICHERUNG.125
7.3 PCR UND PRODUKTDETEKTION.127
7.4 NACHWEIS BASIEREND AUF DER AMPLIFIKATION SPEZIFISCHER RNA.128
7.5 NACHWEIS SPEZIFISCHER RNA MIT NASBA.130
7.6 QUANTITATIVE ANALYSE.131
7.7 DISKREPANZ ZWISCHEN REALEN UND ANGEIMPFTEN PROBEN.131
8 SCHLUSSFOLGERUNG
134
9 LITERATUR
135
10 ANHANG.148
10.1 ABKUERZUNGEN.148
10.2 NAEHRMEDIEN UND LOESUNGEN. 148
10.2.1 NAEHRMEDIEN.148
10.2.2 PUFFER.149
10.3 VORSICHTSMASSNAHMEN BEIM ARBEITEN MIT RNA. 149 |
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