Entwicklung von immunchemischen Schnellverfahren für bakterielle Glutamatdecarboxylase zum Nachweis von E. coli und coliformen Keimen:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
SCHRIFTTUM
2
2.1
ALLGEMEINES
UEBER
GLUTAMATDECARBOXYLASE
(GAD)
2
2.1.1
EIGENSCHAFTEN
2
2.1.2
DIE
BEDEUTUNG
VON
GAD
IN
DER
MIKROBIOLOGIE
3
2.2
NACHWEISVERFAHREN
FUER GAD
4
2.2.1
INDIREKTE
VERFAHREN
4
2.2.1.1
PH-WERT-VERAENDERUNG
4
2.2.1.2
GABA-BESTIMMUNG
5
2.2.1.3
MESSUNG
DES
GLUTAMAT-VERBRAUCHS
MITTELS
BIOSENSOR
5
2.2.1.4
COZ-BESTIMMUNG
6
2.2.2
DIREKTE
VERFAHREN
6
2.2.2.1
GENOTYPISCHER
NACHWEIS
6
2.2.2.2
IMMUNOLOGISCHE
VERFAHREN
7
2.3
SCHNELLDETEKTIONSVERFAHREN
FUER
E.
COLI
UND
COLIFORME
KEIME
8
2.3.1
ENZYMATISCHE
NACHWEISVERFAHREN
8
2.3.2
IMMUNCHEMISCHE
METHODEN
9
2.3.2.1
IMMUNCHEMISCHE
SCHNELLTESTS
10
2.3.3
SCHNELLTESTFORMEN
11
2.3.3.1
TESTSTREIFEN-TESTS
11
2.3.3.2
IMMUNFILTRATION
11
2.3.3.3
IMMUNCHROMATOGRAPHISCHE
TESTS
11
2.3.4
GENSONDEN
12
2.3.5
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
(PCR)
12
2.3.6
IMPEDANZMESSUNG
13
2.3.7
AUTOFLUORESZENZ
13
2.3.8
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
14
2.3.9
BIOLUMINESZENZ-ATP-MESSUNG
14
2.3.10
BIOSENSOREN
14
3
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
20
3.1
MATERIALIEN
20
3.1.1
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKA
20
3.1.2
LOESUNGEN
UND
PUFFER
21
3.1.3
ANTIKOERPER
UND
ANTIGEN-ENZYM-KONJUGATE
21
3.1.4
MEMBRANEN
21
3.1.5
GERAETE
22
3.1.6
SONSTIGES
22
3.1.7
WASSERPROBEN
23
3.2
ERSTELLUNG
EINES
VERKUERZTEN
MIKROTITERPLATTENSYSTEMS
24
3.2.1
UEBERPRUEFUNG
DER
INUNUNREAGENZIEN
IM
MIKROTITERPLATTEN-EIA
24
3.2.1.1
DURCHFUEHRUNG
24
3.2.1.2
ERGEBNISSE
24
3.2.2
HERSTELLUNG
DER
ANTIKOERPER-BIOTIN-KONJUGATE
25
3.2.2.1
UEBERPRUEFUNG
DER
HERGESTELLTEN
KONJUGATE
IM
MIKROTITERPLATTEN-EIA
27
3.2.2.2
ERGEBNISSE
27
3.2.3
VERSUCH
ZUR
OPTIMIERUNG
28
3.2.3.1
DURCHFUEHRUNG
28
3.2.3.2
ERGEBNISSE
29
3.2.4
VERSUCHE
ZUR
VERKUERZUNG
DER
TESTDAUER
29
3.2.4.1
DURCHFUEHRUNG
29
3.2.4.2
ERGEBNISSE
29
3.2.5
VERSUCH
ZUR
KONSERVIERUNG
DER
A-GAD-BIOTIN-KONJUGATE
31
3.2.5.1
DURCHFUEHRUNG
31
3.2.5.2
ERGEBNISSE
32
3.2.6
ANWENDUNG
DES
BIOTIN-MIKROTITERPLATTEN-EIA
ZUM
NACHWEIS
VON
GAD
IN
AUFBEREITETEN
WASSERPROBEN
32
3.2.6.1
DURCHFUEHRUNG
32
3.2.6.2
ERGEBNISSE
33
3.2.7
ENTWICKLUNG
VON
TESTSTREIFEN-ENZYMIMMUNTESTS
ZUM
NACHWEIS
VON
GAD
34
3.2.7.1
PRINZIP
34
3.2.7.2
HERSTELLUNG
34
3.2.7.3
TESTDURCHFUEHRUNG
34
3.2.7.4
AUSWERTUNG
UND
FESTLEGUNG
DER
NACHWEISGRENZE
35
3.2.8
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
36
3.2.8.1
UEBERPRUEFUNG
DER
VERSCHIEDENEN
ANTISEREN
IN
KOMBINATION
MIT
DEN
VERSCHIEDENEN
KONJUGATEN
36
3.2.8.2
ERGEBNISSE
36
3.2.9
VERSUCHE
ZUR
VERKUERZUNG
DER
GESAMTTESTDAUER
37
3.2.9.1
DURCHFUEHRUNG
37
3.2.9.2
ERGEBNISSE
38
3.2.10
ENTWICKLUNG
EINES
IMMUNFILTRATIONS-TESTSYSTEMS
FUER
GAD
38
3.2.10.1
PRINZIP
38
3.2.10.2
AUFBAU
DES
TESTSYSTEMS
38
3.2.10.3
HERSTELLUNG
DER
TESTMEMBRANEN
39
3.2.10.4
TESTDURCHFUEHRUNG
39
3.2.10.5
TESTAUSWERTUNG
40
3.3
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DES
TESTSYSTEMS
40
3.3.1
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
FESTPHASE
40
3.3.1.1
UEBERPRUEFUNG
VON
VERSCHIEDENEN
MEMBRANEN
40
3.3.1.2
ERGEBNISSE
41
3.3.1.3
UEBERPRUEFUNG
VON
UNTERSCHIEDLICHEN
ABSAETTIGUNGSLOESUNGEN
42
3.3.1.4
ERGEBNISSE
42
3.3.1.5
VERSUCHE
ZUR
BESCHICHTUNG
DER
IMMUNFILTRATIONSMEMBRAN
MIT
EINEM
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE-AUFTRAGEGERAET
43
3.3.1.6
ERGEBNISSE
44
3.3.2
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
INUNUNOREAGENZIEN
45
II
3.3.2.1
ERMITTLUNG
DES
OPTIMALEN
ANTISERUMS
UND
DER
OPTIMALEN
ANTISERUM-KONZENTRATION
45
3.3.2.2
ERGEBNISSE
45
3.3.2.3
UEBERPRUEFUNG
VON
UNTERSCHIEDLICHEN
KONJUGAT-VERDUENNUNGEN
46
3.3.2.4
ERGEBNISSE
46
3.3.2.5
UEBERPRUEFUNG
VON
UNTERSCHIEDLICHEN
ENZYM-KONJUGAT-VOLUMINA
46
3.3.2.6
ERGEBNISSE
47
3.3.2.7
UEBERPRUEFUNG
VON
VERSCHIEDENEN
KONJUGATEN
47
3.3.2.8
ERGEBNISSE
47
3.3.2.9
UEBERPRUEFUNG
VON
UNTERSCHIEDLICHEN
KONJUGATFRAKTIONEN
48
3.3.2.10
ERGEBNISSE
48
3.3.2.1
1
UEBERPRUEFUNG
VON
ZUSAETZEN
ZUM
KONJUGAT-PUFFER
49
3.3.2.12
ERGEBNISSE
50
3.3.2.13
UEBERPRUEFUNG
VON
UNTERSCHIEDLICH
KONSERVIERTEN
KONJUGATEN
50
3.3.2.14
ERGEBNISSE
50
3.3.2.15
EINSATZ
DER
A-GAD-BIOTIN-KONJUGATE
IM
IMMUNFILTRATIONSSYSTEM
51
3.3.2.16
ERGEBNISSE
51
3.3.3
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
WASCHLOESUNG
52
3.3.3.1
UEBERPRUEFUNG
VERSCHIEDENER
WASCHLOESUNGEN
52
3.3.3.2
ERGEBNISSE
52
3.3.3.3
EINFLUSS
DER
MENGE
DER
WASCHLOESUNG
AUF
DIE
FARBREAKTION
52
3.3.3.4
ERGEBNISSE
52
3.3.4
VERSUCHE
ZUR
OPTIMIERTEN
TESTAUSFUEHRUNG
53
3.3.4.1
VERSUCH
ZUR
ERHOEHUNG
DER
PROBENMENGE
53
3.3.4.2
ERGEBNISSE
53
3.3.4.3
VERSUCHE
ZUR
VERKUERZUNG
DER
GESAMTTESTZEIT
53
3.3.4.4
ERGEBNISSE
54
3.3.4.5
OPTIMIERTE
TESTDURCHFUEHRUNG
55
3.3.5
ANWENDUNG
DER
IMMUNFILTRATIONS-ENZYMTESTS
ZUM
NACHWEIS
VON
GAD
IN
AUFBEREITETEN
WASSERPROBEN
57
3.3.5.1
DURCHFUEHRUNG
57
3.3.5.2
ERGEBNISSE
57
3.3.5.3
VERSUCH
ZUR
REDUZIERUNG
VON
MOEGLICHEN
INTERFERENZEN
DURCH
STOERENDE
PROBENBESTANDTEILE
59
3.3.5.4
ERGEBNISSE
59
3.3.5.5
AUSWERTUNG
DER
TESTERGEBNISSE
59
3.3.5.6
ERGEBNISSE
60
4
DISKUSSION
61
4.1
ERSTELLUNG
DES
BIOTIN-MIKROTITERPLATTENSYSTEMS
61
4.2
ERSTELLUNG
DES
IMMUNFILTRATIONSSYSTEMS
62
4.3
TESTSTREIFEN
63
4.4
PRAKTIKABILITAET
65
4.5
AUSBLICK
66
M
5
ZUSAMMENFASSUNG
67
6
LITERATURVERZEICHNIS
70
7
ANHANG
84
IV |
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