Induktion von Faktor-VIII-Antikörpern in Hämophilie-A-Mäusen mit humanem FVIII: ein Tiermodell für Inhibitor-Patienten mit "High-responder"-Phänotyp
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 DIE HAEMOSTASE.1
1.2 DIE ZELLULAERE HAEMOSTASE.1
1.3 DAS PLASMATISCHE GERINNUNGSSYSTEM.2
1.4 DER VON WILLEBRAND FAKTOR - FAKTOR VIH-KOMPLEX.5
1.5 DER FAKTOR VIH.5
1.5.1 DAS FAKTOR VIII-GEN.5
1.5.2 DAS FVIII-PROTEIN UND SEINE POSTTRANSLATIONALE MODIFIZIERUNG.6
1.5.3 DIE FAKTOR VHI-SYNTHESE.7
1.5.4 FAKTOR VIII IM PLASMA.'.8
1.5.5 DIE BINDUNG DES FVIII AN DEN VON WILLEBRAND FAKTOR.10
1.6 DER VON WILLEBRAND FAKTOR (VWF).11
1.6.1 DAS VWF-GEN.11
1.6.2 DAS VWF-PROTEIN.11
1.6.3 DIE VWF-SYNTHESE.13
1.6.4 VWF IM PLASMA.14
1.6.5 DIE BINDUNG DES VWF AN DEN FVIII.15
1.6.6 DER FVIII-VWF-KOMPLEX IN DER HAEMOSTASE.15
1.7 GERINNUNGSSTOERUNGEN.VR.20
1.8 THERAPIE DER HAEMORRHAGISCHE DIATHESEN AM BEISPIEL DER HAEMOPHILIE A.
21
1.9 KOMPLIKATIONEN BEI DER BEHANDLUNG VON HAEMOPHILIE A-PATIENTEN.22
1.10 FVIII INHIBITOREN.23
1.10.1 KLASSIFIZIERUNG VON FVIII-ANTIKOERPERN.23
1.10.2 MECHANISMEN DER FVIII-INHIBITION.24
1.10.3 FAKTOREN, DIE DIE INZIDENZ DER INHIBITOR-BILDUNG IN KLINISCHEN
STUDIEN BEEINFLUSSEN. 26
1.11 AUFGABENSTELLUNG.28
1.12 DIE STRATEGIE DER ARBEIT.29
2 MATERIAL UND METHODEN.30
2.1 MATERIAL.30
2.1.1 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN, TECHNISCHE APPARATE,
VERBRAUCHSMATERIAL.30
2.1.2 VERWENDETE BIOLOGISCHE PRAEPARATE.32
2.1.3 VERWENDETE TESTKITS.34
2.2 METHODEN DER FVIII-PRODUKT-CHARAKTERISIERUNG.35
2.2.1 PRAEPARATION, REKONSTITUTION UND LAGERUNG VON PLASMA-PRAEPARATEN,
FVIII- BZW.
VWF-PRODUKTEN UND STANDARDS.35
2.2.2 PLASMAPROTEINBESTIMMUNG,.36
2.2.3 BESTIMMUNGEN DES VWF.38
2.2.4 BESTIMMUNGEN DES FVIII.41
2.2.5 CHARAKTERISIERUNG DES FVIII-VWF-KOMPLEXES.46
2.3 LN VITRO PRAEPARATION VON PLASMAPROTEINEN UND PROTEIN-FRAGMENTEN.48
2.3.1 PRAEPARATION VON VWF AUS HAEMOCTIN SDH.48
2.3.2 PRAEPARATION VON GLUTATHION S-TRANSFERASE-(GST)
FVIII-FUSIONSPROTEINEN IN E. COLI. 49
2.4 ENTWICKLUNG EINES IMMUNOGENITAETSTESTS FUER FVIII-PRAEPARATIONEN AM
HAEMOPHILIE
A-MAUSMODELL .50
2.4.1 HALTUNG, ZUCHT UND BEHANDLUNG DER HAEMOPHILIE A MAEUSE.50
2.4.2 CHARAKTERISIERUNG DER IMMUNANTWORT VON HAEMOPHILIE-A-MAEUSEN NACH
FVHI-INJEKTION.52
2.5 STATISTISCHE METHODEN UND VERWENDETE SOFTWARE.58
3 ERGEBNISSE.61
3.1 CHARAKTERISIERUNG VON FVIII-PRAEPARATEN.61
3.1.1 HERSTELLUNGSVERFAHREN UND STABILISIERUNG.61
3.1.2 BESTIMMUNG DES GESAMTPROTEINS.63
3.1.3 VERTEILUNG VON BEGLEITPROTEINEN.64
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.1.4 DER VWF IN FVIII-PRAEPARATEN.65
3.1.5 DER FVIII IN FVIII-PRAEPARATEN.70
3.1.6 DER FVIII-VWF-KOMPLEX IN FVIII-PRODUKTEN UND SEINE STABILITAET.78
3.1.7 UNTERSUCHUNG DER FVIIIC-STABILITAET.81
3.1.8 STABILITAET VON FVIII-KONZENTRATEN NACH VERDUENNUNG UND IN
VITRO-STABILISIERUNG.82
3.2 IN VITRO PRAEPARATION VON PLASMAPROTEINEN UND PROTEIN-FRAGMENTEN.85
3.2.1 PRAEPARATION VON VWF AUS HAEMOCTIN SDH.85
3.2.2 PRAEPARATION UND CHARAKTERISIERUNG VON GST-FVIII-FUSIONSPROTEINEN
(GST = GLUTATHION S-TRANSFERASE).86
3.3 ENTWICKLUNG EINES IMMUNOGENITAETSTESTS FUER FVIII-PRODUKTE AM
HAEMOPHILIE A-
MAUSMODELL.'.88
3.3.1 ZUCHT VON HAEMOPHILIE A-MAEUSEN, PHAENOTYPISCHE EXPRESSION DER
HAEMOPHILIE UND
CHARAKTERISIERUNG EINIGER PLASMAPROTEINE.88
3.3.2 WIEDERFINDUNG VON FVIII NACH VENOESER APPLIKATION IN HAEMOPHILIE
A-MAEUSEN.89
3.3.3 INHIBITOR-INDUKTION NACH VARIATION DER APPLIZIERTEN
FVIIIC-DOSIS.90
3.3.4 VARIATION DER ZAHL DER INJEKTIONEN UND DER TAGE BIS ZUR
BLUTABNAHME.91
3.3.5 DURCHFUEHRUNG DER FVIII-IMMUNOGENITAETS-UNTERSUCHUNGEN.92
3.3.6 MORTALITAET.92
3.4 CHARAKTERISIERUNG DER PLASMEN VON BEHANDELTEN MAEUSEN.93
3.4.1 BESTIMMUNG DER INHIBIERENDEN ANTIKOERPER (BETHESDA-ASSAY) .TT.93
3.4.2 BESTIMMUNG DER GESAMT-IGG-KONZENTRATION IN DEN HAEMOPHILIE
A-MAUSPLASMEN.99
3.4.3 BESTIMMUNG DER ANTI-VWF-IGG-KONZENTRATION IN DEN HAEMOPHILIE
A-MAUSPLASMEN.100
3.4.4 BESTIMMUNG DER ANTI-FVIII-IGG-KONZENTRATION GEGEN RFVIII.102
3.4.5 EPITOP-CHARAKTERISIERUNG MIT GST-FVIII-FUSIONSPROTEINEN.105
4 DISKUSSION.110
4.1 TIERMODELLE ZUR UNTERSUCHUNG DER INHIBITORPROBLEMATIK DER HAEMOPHILIE
A.110
4.1.1 BISHER VEROEFFENTLICHTE STUDIEN.110
4.1.2 DIE MAUS ALS EIN MODELL DER HUMANEN GERINNUNG.113
4.1.3 DIE FAKTOR VIII-EXON 17-KNOCKOUT-MAUS ALS MODELL FUER EINE FVIII
IMMUNOGENITAETSUNTERSUCHUNG.113
4.2 DIE CHARAKTERISIERUNG DER UNTERSUCHTEN FAKTOR VHI-PRODUKTEN.114
4.2.1 DIE ZUSAMMENSETZUNG DER PROTEINE.114
4.2.2 DIE QUALITAET DES VON WILLEBRAND FAKTORS.117
4.2.3 DIE FVIII-ANTIGENITAET.118
4.2.4 DIE FAKTOR VIII-AKTIVITAET UND -STABILITAET.118
4.3 DIE HAEMOPHILIE A-MAUS ALS TIERMODELL FUER PATIENTEN MIT
YYHIGH RESPONDER" PHAENOTYP.119
4.3.1 IMUNOGENITAETSUNTERSUCHUNGEN VON FVIII-PRODUKTEN.119
4.3.2 VERGLEICH DER IM HAEMOPHILIE A-MAUSMODELL ERZIELTEN IMMUNREAKTION
MIT DEN KLINISCHEN STUDIEN. 124
4.3.3 DIE MECHANISMEN, DIE EINE ERHOEHTE IMMUNOGENITAET IN FVIII-PRODUKTEN
HERVORRUFEN KOENNEN.128
4.3.4 DIE BINDUNG DES FVIII AN DEN VWF BEEINFLUSST DIE
INHIBITOR-INDUKTION.130
4.3.5 PERSPEKTIVE DES HAEMOPHILIE A-MAUSMODELLS FUER DIE ERFORSCHUNG DER
IMMUNANTWORT GEGEN FAKTOR VIII.132
5 LITERATUR. 133
6 ANHANG.146
6.1 VERGLEICH DER HOMOLOGIE DER FVIII-DOMAENEN VON MENSCH UND MAUS.146
6.2 TABELLEN ZUM U-TEST NACH MANN-WHITNEY.158
7 ZUSAMMENFASSUNG
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