Biochemische Charakterisierung von KA 672 als neuer Hemmstoff der Azetylcholinesterase in vitro und Nachweis der Wirkung in vivo:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS SEITE
1 EINLEITUNG 1
1.1 AZETYLCHOLINESTERASE 1
1.1.1 EINFUEHRUNG 1
1.1.2 BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN 1
1.1.3 MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN UND VORKOMMEN 2
1.1.4 HEMMSTOFFE DER AZETYLCHOLINESTERASE 4
1. 2 DIE ALZHEIMER-ERKRANKUNG 7
1.2.1 DEFINITION DER ALZHEIMER-ERKRANKUNG 7
1.2.2 HISTOPATHOLOGISCHE MERKMALE 7
1.2. 3 VERAENDERUNGEN IM BEREICH DER NEUROTRANSMITTER UND
NEUROPEPTIDE 9
1.2.4 DAS CHOLINERGE SYSTEM 9
1.2.5 DIE CHOLINERGE HYPOTHESE 11
1.2.6 AZETYLCHOLINESTERASE UND DIE ALZHEIMER-ERKRANKUNG 12
1. 2. 7 DIE BESTIMMUNG DER ACHE-AKTIVITAET IN VIVO 13
1.2. 8 THERAPIESTRATEGIEN 14
1.3KA672 16
1.4
PROBLEMSTELLUNG 17
2 MATERIAL UND METHODEN 19
2.1 CHEMIKALIEN 19
2.2 METHODEN 20
2. 2.1 PRAEPARATION DER AZETYLCHOLINESTERASE 20
2. 2.1.1 HERSTELLEN DER GEKOPPELTEN SEPHAROSE 20
2. 2.1. 2 HERSTELLEN DER ENZYMPRAEPARATION 21
2. 2. 2 SDS-POLYACRYLAMIDELEKTROPHORESE
23
2. 2. 3 PROTEIN-SILBERFAERBUNG
24
2. 2. 4 WESTERN-BLOT
24
2.2. 5 PROTEINBESTIMMUNG NACH PETERSON
25
2.2. 6 DARSTELLUNG DER HEMMKINETIK DER ACHE DURCH KA 672
25
2. 2. 7 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ACHE-AKTIVITAET
IN VITRO 26
2. 2. 8 RADIOCHEMISCHE BESTIMMUNG DER ACHE-AKTIVITAET
IN VITRO 27
2.2. 9 DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION NACH MARTIN UND ARNES
28
2. 2.10 TIEREXPERIMENTELLER TEIL 29
2.2.10.1
1N-VIVO-BESTIMMUNG DER ACHE-AKTIVITAET UND
EX-V/VO-BESTIMMUNG DER ACHE-AKTIVITAET 29
2. 2.10. 2 APPLIKATION DES IMMUNOTOXINS
30
2. 2.10. 3 HISTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DER ACHE-AKTIVITAET
31
3 ERGEBNISSE 32
3.1 DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE AUS DEN VERSUCHEN
IN VITRO 32
3.1.1
REINIGUNG DER ACHE AUS RATTENHIRNHOMOGENAT 32
3.1.2
HEMMUNG DER ACHE DURCH KA 672 IN VITRO 35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.1. 2. 1 KINETISCHE GRUNDPARAMETER DER ACHE
36
3.1. 2. 1.1 VERSUCHE MIT GEREINIGTEM DETERGENSLOESLICHEN ENZYM
36
A) ERGEBNISSE MIT AZETYLCHOLINIODID ALS SUBSTRAT 36
B) ERGEBNISSE MIT AZETYLTHIOCHOLIN ALS SUBSTRAT 39
3.1. 2.1.1 VERSUCHE MIT GEREINIGTEM WASSERLOESLICHEN ENZYM
42
3. 1. 2. 1. 3 ZUSAMMENFASSUNG 44
3.1.2. 2 HEMMUNG DER ACHE-REAKTION DURCH DEN INHIBITOR
45
3.1.2. 2.1 ERGEBNISSE MIT DETERGENSLOESLICHER ACHE 46
A) ERGEBNISSE MIT AZETYLCHOLINIODID ALS SUBSTRAT 46
B) ERGEBNISSE MIT AZETYLTHIOCHOLIN ALS SUBSTRAT 56
3. 1. 2. 2. 2 VERSUCHE MIT GEREINIGTER WASSERLOESLICHER ACHE 62
3.1. 2. 2. 3 ZUSAMMENFASSUNG 65
3.1. 2. 2.4 WIRKUNG DES INHIBITORS AUF DIE MOLEKULAREN FORMEN 65
3. 2 VERSUCHE ZUR HEMMUNG DER ACHE DURCH KA 672
IN VIVO
UND
EX VIVO
66
3. 2.1 VORVERSUCHE FUER DIE UEBERLEBENSZEIT DER TIERE NACH
INJEKTION VON
14C-MARKIERTEM N-METHYL-3-PIPERIDYL-AZETAT 67
3. 2. 2 VERSUCHE EX VIVO UND IN VIVO 67
3. 2. 3 PRUEFUNG DER METHODE AN EINEM TIER NACH LAESION
DES NUCLEUS BASALIS MAGNOCELLULARIS 70
4 DISKUSSION 72
4.1 REINIGUNG DER ACHE AUS RATTENHIRNHOMOGENAT, DISKUSSION DER METHODE
72
4.2 REINHEIT DER ENZYMPRAEPARATION
74
4. 3 ENZYMKATALYSE
75
4. 3. 1 DETERGENSLOESLICHE ACHE 76
4. 3. 2 WASSERLOESLICHE ACHE 77
4.4 HEMMUNG DER ACHE AUS RATTENHIRNHOMOGENAT MIT KA 672
IN VITRO
77
4. 4. 1 DETERGENSLOESLICHE ACHE 78
4. 4. 2 WASSERLOESLICHE ACHE 80
4. 4, 3 WIRKUNG VON KA 672 AUF DIE UNTERSCHIEDLICHEN MOLEKULAREN FORMEN
80
4.5 DISKUSSION DER ERGEBNISSE AUS DEN VERSUCHEN EX
VIVO
UND
IN VIVO
81
4. 5. 1 DISKUSSION DER ERGEBNISSE AUS DEN VERSUCHEN EX VIVO 81
4. 5. 2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE AUS DEN VERSUCHEN
IN VIVO 82
4. 5. 2.1 LAESION DES NUCLEUS BASALIS MAGNOCELLULARIS
83
4. 5. 2. 2 DISKUSSION DER METHODE
84
5 ZUSAMMENFASSUNG
86
6
LITERATURVERZEICHNIS
88
7 ANHANG
104 |
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