Herstellung rekombinanter Adenoviren zum Transfer des Suizidgens Cytosin Desaminase in hepatozelluläre Karzinome:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Hohenheim, Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | 181 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
19
1.1
GENTHERAPIE
.
19
1.2
GENTRANSFER-SYSTEME
.
20
1.2.1
NICHT-VIRALE
GENTRANSFER-SYSTEME
.
20
1.2.2
VIRALE
GENTRANSFER-SYSTEME
.
21
1.2.2.1
RETROVIREN
.
21
1.2.2.2
ADENO-ASSOZIIERTE
VIREN
.
22
1.2.2.3
ADENOVIREN
.
22
1.3
GENTHERAPIE
VON
LEBERERKRANKUNGEN
UND
HEPATOZELLULAEREN
KARZINOMEN
23
1.3.1
ANTISENSE-RNA
ZUR
INAKTIVIERUNG
VON
ONKOGENEN
.
25
1.3.2
EINFUEGEN
VON
FUNKTIONELLEN
TUMORSUPPRESSORGENEN
.
25
1.3.3
STIMULIERUNG
DER
IMMUNREAKTION
GEGEN
TUMOREN
.
26
1.3.4
ANTIANGIOGENESE
.
26
1.3.5
SUIZIDGENTHERAPIE
.
27
1.4
FRAGESTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
30
2
MATERIAL
UND
METHODEN
31
2.1
ALLGEMEINES
.
31
2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
31
VI
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1
PLASMIDE
.
32
2.2.1.1
PCD2
.
32
2.2.1.2
PCDNA3
.
32
2.2.1.3
PTG3602
.
33
2.2.1.4
PTG6600
.
34
2.2.1.5
PTG8347
.
34
2.2.2
BAKTERIENSTAEMME
.
35
2.2.2.1
ESCHERICHIA
COLI XL
1
-BLUE
.
35
2.2.2.2
ESCHERICHIA
COLI
JM1
10
.
35
2.2.2.3
ESCHERICHIA
COLI
BJ5183
.
35
2.2.3
ANLEGEN
VON
GLYCEROLKULTUREN
.
36
2.2.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
36
2.2.5
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
.
38
2.2.6
PLASMIDPRAEPARATIONEN
.
40
2.2.6.1
MINI-PRAEPARATIONEN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRANSFORMIER
TEN
BAKTERIEN
.
40
2.2.6.2
MAXI-PRAEPARATIONEN
ZUR
PLASMIDGEWINNUNG
.
42
2.2.7
SPEKTROMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA-LOESUNGEN
44
2.2.8
VERDAU
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
.
45
2.2.8.1
ANALYTISCHER
VERDAU
VON
DNA
.
45
2.2.8.2
PRAEPARATIVER
VERDAU
VON
DNA
.
46
2.2.9
GLAETTEN
UBERHAENGENDER
ENDEN
VON
DOPPELSTRANG-DNA
.
47
2.2.9.1
AUFFUELLEN
5
'
-UEBERHAENGENDER
ENDEN
MIT
KLENOW-ENZYM
.
47
2.2.9.2
ABBAU
3
'
-UEBERHAENGENDER
ENDEN
MIT
T4-POLYMERASE
.
48
INHALTSVERZEICHNIS
VH
2.2.10
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARER
DOPPELSTRANG-DNA
.
48
2.2.11
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
49
2.2.12
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
PRAEPARATIVEN
AGAROSEGELEN
.
51
2.2.13
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
.
53
2.2.13.1
LIGATION
VON
ELUIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
.
54
2.2.13.2
YYEIN-TOPF-LIGATION
"
.
55
2.2.14
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
AUS
ADHAERENTEN
ZELLEN
.
57
2.2.15
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-DNA
AUS
ORGANEN
UND
GEWEBEN
.
58
2.2.16
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
59
2.2.16.1
GEWINNUNG DES ZELLYSATS
AUS
ADHAERENTEN
ZELLEN
.
59
2.2.16.2
GEWINNUNG
DES
ZELLYSATS
AUS
ORGANEN
UND
GEWEBEN
.
60
2.2.16.3
RNA-EXTRAKTION
.
61
2.2.17
SPEKTROMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
RNA-LOESUNGEN
62
2.2.18
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
63
2.2.18.1
PRIMER-DESIGN
.
63
2.2.18.2
ZUSAMMENSETZUNG
UND
REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
64
2.2.19
POLYMERASE-KETTENREAKTION
NACH
CDNA-SYNTHESE
DURCH
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
67
2.2.19.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
67
2.3
ZELLBIOLOGISCHE
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
69
2.3.1
VERWENDETE
ZELLINIEN
.
69
2.3.2
ZELLKULTUR
.
70
2.3.2.1
ALLGEMEINES
.
70
2.3.2.2
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
71
VIII
2.3.2.3
ZELLPASSAGE
.
71
2.3.2.4
KRYOKONSERVIERUNG
VON
ZELLEN
.
72
2.3.2.5
ZELLZAEHLUNG
MIT
DEM
HAEMOCYTOMETER NACH
NEUBAUER
.
73
2.3.3
TRANSFEKTION
.
74
2.3.3.1
TRANSFEKTION
MIT
LIPOFECTIN
.
74
2.3.4
PROLIFERATIONSTEST
ZUR
BESTIMMUNG
DER
SUIZIDGENWIRKUNG
.
75
2.4
VIROLOGISCHE
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
77
2.4.1
ADENOVIREN
.
77
2.4.2
REPLIKATIONSDEFIZIENTE
ADENOVIREN
.
78
2.4.3
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
ADENOVIREN
.
78
2.4.3.1
HOMOLOGE
REKOMBINATION
IN
ESCHERICHIA
COLI
BJ5
183
.
.
81
2.4.3.2
PROPAGATION
VON
ADENOVIREN
UND
HERSTELLUNG
VON
ADENO
VIRUS-ROHEXTRAKT
.
83
2.4.3.3
HERSTELLUNG
GEREINIGTER
ADENOVIRUS-LOESUNGEN
.
84
2.4.4
TITERBESTIMMUNG
VON
ADENOVIRUS-LOESUNGEN
.
85
2.4.4.1
YYPLAQUE-ASSAY
"
.
86
2.4.4.2
ZELLFIXIERUNG
UND
KRISTALLVIOLETT-FAERBUNG
.
87
2.4.5
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
ADENOVIRUS-DNA
.
88
2.4.5.1
ISOLIERUNG
VON
ADENOVIRUS-DNA
.
88
2.4.5.2
PCR
DER
ADENOVIRUS-DNA
IM
BEREICH
DER
EIA
SOWIE
DER
E2B-GENREGION
.
89
2.4.5.3
PCR
DER
ADENOVIRUS-DNA
IM
BEREICH
DES
CYTOSIN
DESAMINASE
GENS
.
89
2.4.6
TRANSDUKTION
VON
ADHAERENTEN
ZELLEN
MIT
ADENOVIRUS
.
90
2.5
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
91
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
IX
2.5.1
ZELLAUFSCHLUSS
.
91
2.5.1.1
PROTEIN-ISOLIERUNG
AUS
ADHAERENTEN
ZELLEN
.
91
2.5.1.2
PROTEIN-ISOLIERUNG
AUS
ORGANEN
UND
GEWEBEN
.
92
2.5.2
PROTEIN-BESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
92
2.5.3
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
.
93
2.5.4
WESTERN
BLOTTING
.
97
2.5.4.1
YYSEMI-DRY
BLOTTING
"
.
98
2.5.4.2
ECL-DETEKTIONSSYSTEM
.
99
2.6
DAS
MORRIS
HEPATOM
MODELL
DER
ACI-RATTE
.
102
2.6.1
DAS
MORRIS
HEPATOM
3924A
.
102
2.6.2
DIE
ACI-RATTE
ALS
TIERMODELL
.
102
2.6.2.1
TIERHALTUNG
.
102
2.6.2.2
NARKOSE
.
104
2.6.3
ANZUCHT
SUBKUTANER
MORRIS
HEPATOM
TUMOREN
.
104
2.6.4
ORTHOTOPE
TUMORIMPLANTATION
IN
DIE
LEBER
.
105
2.6.5
VEKTORAPPLIKATION
UEBER
DIE
ARTERIA
HEPATICA
.
106
2.6.6
INJEKTION
VON
5-FLUORCYTOSIN
UND
BESTIMMUNG
DES
5-FLUORCYTOSIN
SERUMSPIEGELS
.
108
2.6.7
MAGNETISCHE
RESONANZ-TOMOGRAPHIE
ZUR
TUMORDARSTELLUNG
.
.
.
108
2.6.8
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
.
108
3
ERGEBNISSE
109
3.1
PLASMIDKONSTRUKTE
.
109
3.1.1
DAS
EXPRESSIONSPLASMID
PCDNA3-CD
.
110
3.1.2
DIE
REKOMBINATIONSPLASMIDE
PTG6600-CD
UND PTG8347-CD
.
112
X
INHALTSVERZEICHNIS
3.2
HERSTELLUNG
EINER
STABIL
CD-EXPRIMIERENDEN
MORRIS
HEPATOM
ZELLINIE
116
3.3
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
CD-EXPRIMIERENDEN
ADENOVIREN
.
121
3.3.1
ADENOVIRUS-CMV-CD
.
121
3.3.2
ADENOVIRUS-RSV-CD
.
121
3.3.3
UEBERPRUEFUNG
DER
REKOMBINANTEN
CD-EXPRIMIERENDEN
ADENOVIREN
123
3.3.3.1
PCR
DER
ADENOVIRUS-DNA
IM
BEREICH
DER
EIA
SOWIE
DER
E2B-GENREGION
.
123
3.3.3.2
PCR
DER
ADENOVIRUS-DNA
IM
BEREICH
DES
CYTOSIN
DESAMINASE
GENS
.
126
3.3.3.3
NACHWEIS
DER
VIRAL
VERMITTELTEN
CD-EXPRESSION
.
126
3.3.3.4
PROLIFERATIONSTEST
ZUM
FUNKTIONELLEN
NACHWEIS
DER
VIRAL
EX
PRIMIERTEN
CYTOSIN
DESAMINASE
.
127
3.4
IN
VZVO-EXPERIMENTE
AM
MODELL
DER
ACL-RATTE
.
130
3.4.1
SUBKUTANE
MORRIS
HEPATOM-CD
TUMOREN
.
130
3.4.1.1
ERMITTLUNG
DER
TUMORMASSE
.
131
3.4.1.2
UNTERSUCHUNG
DES
SUBKUTANEN
TUMORGEWEBES
.
133
3.4.1.3
ERMITTLUNG
DER
5
-FC-SERUMSPIEGEL
.
135
3.4.2
ORTHOTOPE
MORRIS
HEPATOM-CD
TUMOREN
.
137
3.4.2.1
ERMITTLUNG
DER
TUMORVOLUMINA
.
137
3.4.2.2
ERMITTLUNG
DES
5-FC-SERUMSPIEGELS
.
138
3.4.2.3
UNTERSUCHUNG
DER
REKULTIVIERTEN
MH-CD-ZELLEN
.
140
3.4.3
IN
V/TO-TRANSDUKTION
ORTHOTOPER
MORRIS
HEPATOM
TUMOREN
.
.
.
144
3.4.3.1
ERMITTLUNG
DER
TUMORVOLUMINA
.
147
3.4.3.2
ERMITTLUNG
DES
5-FC-SERUMSPIEGELS
.
147
3.4.3.3
UNTERSUCHUNG
DER
CD-EXPRESSION
NACH
TRANSDUKTION
.
147
INHALTSVERZEICHNIS
XI
4
DISKUSSION
151
4.1
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
CD-EXPRIMIERENDEN
ADENOVIREN
.
151
4.2
DAS
MORRIS
HEPATOM
MODELL
DER
ACI-RATTE
.
153
4.2.1
SUBKUTANE
MORRIS
HEPATOM-CD
TUMOREN
.
153
4.2.2
ORTHOTOPE
MORRIS
HEPATOM-CD
TUMOREN
.
154
4.2.3
IN
I
/TO-TRANSDUKTION
ORTHOTOPER
MORRIS
HEPATOM
TUMOREN
.
.
.
156
4.3
AUSBLICK
.
158
ZUSAMMENFASSUNG
161
LITERATURVERZEICHNIS
163
ANHANG
173
FIRMENVERZEICHNIS
.
173
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
175 |
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