In-vitro-Charakterisierung der Promotor-Bindung von zwei essentiellen Transkriptionsfaktoren bei Pyrodictium occultum:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Regensburg, Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | IV, 112 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
]
INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG.!
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
_
.
_
.
_
.
-
-----
.7
1.
MATERIAL
.7
1.1
CHEMIKALIEN
.
7
1.2
PLASMIDE
.
8
1.3
ENZYME
UND
ANTIKOERPERKONJ
UGATE
.
8
1.4
ORGANISMEN
.
9
1.5
OLIGONUKLEOTIDE
.
9
2.
MEDIEN
UND
ANZUCHT
VON
ORGANISMEN.
_
.11
2.1
PYRODICTIUM
OCCULTUM
.
11
2.1.1
"SME
^"-MEDIUM
(STETTER
ET
AL.,
1983)
.
11
2,1.2
HERSTELLUNG
DES
ANAEROBEN
MEDIUMS
.
12
2.2
ESCHERICHIA
COLI
.
13
3.
HERSTELLUNG
VON
CHEMISCH
KOMPETENTEN
ZELLEN
.13
4.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
_
.
_
.
-
.
14
4.1
LOESUNGEN
.
14
4.2
PRAEPARATION
IM
MINIMASSSTAB
.
15
4.3
PRAEPARATION
IM
GROSSMASSSTAB
.
15
5.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
PYRODICTIUM
6.
ANALYSE
UND
REINIGUNG
VON
DNA.
.
.16
6.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
16
6.1.1
PHOTOMETRISCH
.
16
6.1.2
ETHIDIUMBROMID-PLATTEN
.
17
6.2
PHENOLISIEREN
VON
DNA
.
17
6.3
ETOH-FAELLUNG
.
18
7.
GELELEKTROPHORESE
VON
DNAYY.
.
.
--------
18
7.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
18
7.1.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
18
7.1.2
DURCHFUEHRUNG
.
19
7.2
NATIVE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
19
7.2.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
19
7.2.2
DURCHFUEHRUNG
.
20
7.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
20
8.
POLYMERASE-KETTEN
REAKTION
(PCR)
.21
8.1
STANDARD-PCR
.
21
8.2
ERMITTLUNG
POSITIVER
TRANSFORMANDEN
MITTELS
PCR
.
22
8.3
EINFUEHRUNG
VON
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
MITTELS
PCR
.
22
8.4
HERSTELLUNG
DIG-MARKIERTER
SONDEN
.
23
8.5
HERSTELLUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
FUER
DIE
DNA-BINDUNGSSTUDIEN
.
24
II
INHALTSVERZEICHNIS
9.
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
_
_
-
.
-
.
-
.
.
24
9.1
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
.
24
9.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
24
9.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
25
9.4
TRANSFORMATION
MIT
CHEMISCH
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
25
9.5
GLYCERINKULTUREN
VON
E.
COLI
.
26
10.
BAKTERIOPHAGEN:
LYSATE
UND
DNA-PRAEPARATION.
.
26
10.1
VORBEREITUNG
DES
WIRTSSTAMMES
(.
COLI
LE392)
.
26
10.2
PHAGENTITER-BESTIMMUNG
.
26
10.3
ISOLIERUNG
VON
BAKTERIOPHAGEN
.
27
10.4
PRAEPARATION
VON
X-PHAGEN
,
MINILYSATE
(FLUESSIGKULTURMETHODE)
.
27
10.5
ISOLIERUNG
DER
PHAGEN-DNA
.
27
11.
IDENTIFIZIERUNG
GESUCHTER
DNA-SEQUENZEN
.
28
11.1
NACHWEIS
IN
E.
COLI
TRANSFORMANDEN
.
28
11.2
NACHWEIS
IN
BAKTERIOPHAGEN
(-DNA)
.
28
11.2.1
PLAQUE-LIFT
.
28
11.2.2
SOUTHERN
BLOT
FRAGMENTIERTER
PHAGEN-DNA
.
28
11.2.2.1
PUFFER
.
28
11.2.2.2
DURCHFUEHRUNG
.
28
11.2.3
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-SONDEN
.
29
11.2.4
NACHWEIS
DIGOXYGENIN-MARKIERTER
DNA
.
29
12.
HETEROLOGE
GENEXPRESSION
IN
E.
COLI.
-------
30
12.1
VERWENDETE
EXPRESSIONSSYSTEME
.
30
12.1.1
VEKTOR
PET
17B
.
30
12.1.2
VEKTOR
PASK-IBA7
.
31
12.2
DURCHFUEHRUNG
.
32
12.2.1
EXPRESSION
IM
MINIMASSSTAB
.
32
12.2.2
EXPRESSION
IM
101
FERMENTER
.
32
13.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
AUS
E.
COLI
.
-------
33
13.1
TBP
.
33
13.1.1
TBP-REINIGUNGSPUFFER
.
33
13.1.2
DURCHFUEHRUNG
.
33
13.2
TFB
.
35
13.2.1
TFB-REINIGUNGSPUFFER
.
35
13.2.2
DURCHFUEHRUNG
.
35
14.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
DER
REKOMBINANTEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
VON
PYRODICTIUM
OCCULTUM
.
36
14.1
ANALYTISCHE
ULTRAZENTRIFUGATION
DES
RPOC-TBPS
.
36
14.2
QUALITATIVE
GELFILTRATION
DES
RPOC-TFBS
.
-
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
III
15.
ANALYSE
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
_
.
.
YY.37
15.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
37
15.1.1
GESAMTPROTEIN-BESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
(1976)
.
37
15.1.1.1
LOESUNGEN
.
37
15.1.1.2
DURCHFUEHRUNG
.
38
15.1.2
GESAMTPROTEIN-BESTIMMUNG
NACH
HEIL
UND
ZILLIG
(1970)
.
38
15.1.2.1
LOESUNGEN
.
38
15.1.2.2
DURCHFUEHRUNG
.
38
15.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
TBP-
UND
TFB-LOESUNGEN
.
39
15.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
39
15.2.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
39
15.2.2
DURCHFUEHRUNG
.
40
15.3
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
40
15.3.1
LOESUNGEN
.
40
15.3.2
DURCHFUEHRUNG
.
40
16.
AUSWERTUNG
VON
DNA
UND
PROTEIN-SEQUENZEN
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY.41
16.1
YYACCESSION
"
NUMMERN
UND
REFERENZEN,
DER
FUER
DIE
HOMOLOGIE-VERGLEICHE
VERWENDETEN
PROTEIN-SEQUENZEN
.
41
17.
GEL-VERZOEGERUNGSTESTS.YYYY.YY.YY.YY.YYYYYYYY.YYYY.YYYYYY.YYYY.YY.YYYYYYYY.YYYYYYYYYY.YYYY.YY.YYYYYY43
17.1
HYBRIDISIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE FUER
DEN
DNA-BINDUNGSTEST
.
43
17.2
STANDARD-ANSATZ
.
44
17.3
SPEZIELLE
ANSAETZE
.
45
111.
ERGEBNISSE
.
46
1.
IDENTIFIZIERUNG
DER
GENE
VON
ZWEI
ESSENTIELLEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
AUS
PYRODICTIUM
OCCULTUM
.
46
1.1
ISOLIERUNG
DES
GENS
FUER
DAS
TATA-BOX-BINDEPROTEIN
(TBP)
.
46
1.1.1
HERSTELLUNG
DER
DNA-SONDE
.
46
1.1.2
KLONIERUNG
DES
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TBP-GENS
.
47
1.1.3
TEILSEQUENZ
DES
BAMH
I-FRAGMENTS
.
50
1.1.4
TBP-SEQUENZANALYSE
.
51
1.1.5
SEQUENZVERGLEICHE
MIT
ARCHAEELLEN
UND
EUKARYONTISCHEN
TBP-GENEN
.
52
1.2
ISOLIERUNG
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
B
(TFB)-GENS
.
55
1.2.1
HERSTELLUNG
EINER
DNA-SONDE
.
55
1.2.2
ISOLIERUNG
DES
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TFB-GENS
AUS
DER
^GENBANK
.
55
1.2.3
KLONIERUNG
DES
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TFB-GENS
.
56
1.2.4
SEQUENZAUSSCHNITT
AUS
DEM
ECORI-KLON
.
58
1.2.5
TFB-SEQUENZANALYSE
.
60
1.2.6
SEQUENZVERGLEICHE
MIT
ARCHAEELLEN
UND
EUKARYONTISCHEN
TFBS
.
63
1.2.7
SEQUENZVERGLEICH
DES
LYSYL-TRNA-SYNTHETASE-FRAGMENTS
.
64
2.
EXPRESSION
DES
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TBP-GENS
IN
E.
COLI.
.
65
2.1
KLONIERUNG
IN
PET
17B
.
65
2.2
EXPRESSION
IN
E.
COLI
.
66
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.
EXPRESSION
DES
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TFB-GENS
IN
E.
COLI.
67
3.1
KLONIERUNG
IN
PET
17B
.
67
3.2
EXPRESSION
IN
E.
COLI
(E.
COLI
BL21
(DE3),
E.
COLI
BL21
(DE3)
PLYSS)
.
67
3.3
UMKLONIERUNG
IN
PASK-IBA7
.
68
3.4
EXPRESSION
IN
E.COLI
(E.
COLI
DH5A,
E.
COLI
BL21
(DE3))
.
68
3.5
EXPRESSION
IN
E.
COLI
BL21-CODONPLUS
(DE3)-RIL
.
68
3.6
UEBERBLICK
UEBER
DIE
EXPRESSION
DES
POC-TFB-GENS
.
69
3.7
EXPRESSION
IM
GROSSMASSSTAB:
PPOC-TFBEX
IN
E.
COLI
BL21-CODONPLUS
.
70
4.
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TBPS
.
71
5.
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TFBS.
73
6.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
DES
REKOMBINANTEN
TBPS
UND
TFBS
.
75
6.1
ANALYTISCHE
ULTRAZENTRIFUGATION
DES
RPOC-TBPS
.
75
6.2 QUALITATIVE
GELFILTRATION
DES
RPOC-TFBS
.
75
7.
IN
VITRO
DNA-BINDUNGSSTUDIEN.
77
7.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
IN
VITRO
BINDUNG
VON
RPOC-TBP
UND
RPOC-TFB
AN
DEN
POC-THERMOSOM
A-GEN
PROMOTOR
.
77
7.1.1
P.
OCCULTUM
THERMOSOM-PROMOTOREN
.
77
7.1.2
NACHWEIS
DER
SPEZIFISCHEN
BINDUNG
DER
REKOMBINANTEN
POC-TRANSKRIPTIONS
FAKTOREN
AN
THS-PROMOTOR-DNA
.
78
7.1.3
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DER
PROMOTOR-BINDUNG
.
79
7.1.4
EINFLUSS
NICHT-AEQUIMOLARER
TBP/TFB
MENGEN
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
.
80
7.1.5
ABHAENGIGKEIT
DER
DNA-BINDUNG
VON
DER
EINGESETZTEN
AEQUIMOLAREN
TBP/TFB-MENGE
.
81
7.1.6
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
.
82
7.1.7
EINFLUSS
STEIGENDER
KCL-KONZENTRATIONEN
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
.
82
7.1.8
EINFLUSS
STEIGENDER
MGCLJ-KONZENTRATIONEN
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
.
83
7.1.9
EINFLUSS
DER
INKUBATIONSDAUER
BEI
90C
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
.
84
7.1.10
PROTEINSTABILITAET
BEI
90C
.
85
7.1.11
EINFLUSS
HOHER
INKUBATIONSTEMPERATUR
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
85
7.2
VERGLEICH
DER
IN
VITRO
BINDUNG
AN
VERSCHIEDENE
PYRODICTIUM
PROMOTOREN
.
87
7.2.1
PYRODICTIUM
OCCULTUM
TATA-BOX
BINDEPROTEIN
PROMOTOR
.
87
7.2.2
PYRODICTIUM
ABYSSI
ISOLAT
TAG11
CANNULAE
UNTEREINHEIT
A
PROMOTOR
.
89
IV.
DISKUSSION
.
_
.
_
.
_
92
V.
ZUSAMMENFASSUNG
-----------------------------
.
.
99
VI.
ANHANG
--------------------------------
.
------------------------
100
VII.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
.
102
VIII.
LITERATURVERZEICHNIS.
104 |
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| author | Lindner, Petra |
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| author_role | aut |
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| discipline | Biologie |
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