Struktur und Funktion der Preseniline sowie ihre Wechselwirkungen mit anderen für die Alzheimer-Krankheit relevanten Proteinen:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 NEUROPATHOLOGIE DER ALZHEIMER KRANKHEIT.1
1.2 DIE MOLEKULARBIOLOGIE DER ALZHEIMER KRANKHEIT.2
1.2.1 DAS AMYLOIDVORLAEUFERPROTEIN (APP).2
1.2.2 DIE PRESENILINE.4
1.3 FUNKTIONEN POTENTIELL GELADENER AMINOSAEUREN IN DEN
TRANSMEMBRANDOMAENEN
VON MEMBRANPROTEINEN.7
2 ZIELSETZUNG UND PROBLEMSTELLUNG DER DOKTORARBEIT. 9
3 ERGEBNISSE.11
3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION DER POTENTIELL GELADENEN AMINOSAEUREN IN
DEN
TRANSMEMBRANDOMAENEN DER PRESENILINE.11
3.1.1 EXPRESSION UND NACHWEIS VON PSI IN COS7 UND SH-SY5Y-ZELLEN.14
3.1.2 KOEXPRESSION UND DETEKTION VON SPA4CT_.20
3.1.3 EINFLUSS DER PRESENILIN-MUTATIONEN AUF DIE ENTSTEHUNG VON ASS.21
3.1.4 MUTATIONEN IN DEN TRANSMEMBRANDOMAENEN VI UND VUE VON PSI
BEEINFLUSSEN DIE ENTSTEHUNG VON HOCHMOLEKULAREN PSI-KOMPLEXEN.23
3.1.5 PSI-MUTATIONEN HABEN KEINEN EINFLUSS AUF DIE BINDUNG VON SS-CATENIN
.26
3.1.6 VERTEILUNG VON APP IN DICHTEGRADIENTEN.27
3.1.7 UNTERSUCHUNGEN ZUR BINDUNG VON ASPARTYLPROTEASEINHIBITOREN AN
PRESENILIN-KOMPLEXE.28
3.2 BACE1, DIE SS-SEKRETASE DER ALZHEIMER KRANKHEIT.37
3.2.1 KLONIERUNG VON BACE1 AUS EINER SH-SY5Y CDNA-BIBLIOTHEK.37
3.2.2 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ANTISEREN GEGEN BACE1.38
3.2.3 EXPRESSION VON BACE1 IN TRANSGENEN DROSOPHILA MELANOGASTER.42
3.3 EXPRESSION VON ALZHEIMER-RELEVANTEN GENEN IN SF9-ZELLEN.45
3.3.1 EXPRESSION VON PS2 IN SF9-ZELLEN.45
3.3.2 EXPRESSION VON SPA4CT IN SF9-ZELLEN.46
3.3.3 ERZEUGUNG VON DUALEN SPA4CT UND PSI (-MUTANTEN) BACULOVIREN.48
4 DISKUSSION.49
4.1 DIE BEDEUTUNG DER POTENTIELL GELADENEN AMINOSAEUREN IN DEN
TRANSMEMBRAN
DOMAENEN VI UND VUE FUER DIE PHYSIOLOGISCHE AKTIVITAET DER PRESENILINE.49
4.1.1 DIE ENDOPROTEOLYSE VON PRESENILIN IST STRENG REGULIERT.50
4.1.2 MUTATIONEN IN DEN TRANSMEMBRANDOMAENEN VI UND VUE VERHINDERN DIE
ENTSTEHUNG HOCHMOLEKULARER PRESENILINKOMPLEXE.52
4.1.3 DIE Y-SEKRETASEAKTIVITAET IST ABHAENGIG VOM VORHANDENSEIN
FUNKTIONELLER
PRESENILINKOMPLEXE.54
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/962018007
4.1.4 NUR FUNKTIONELLE PRESENILINKOMPLEXE BINDEN KLASSISCHE ASPARTYL-
PROTEASEINHIBITOREN.56
4.1.5 MODELL DER ENTSTEHUNG DER HOCHMOLEKULAREN PRESENILINKOMPLEXE.58
4.2 PRESENILIN - DIE Y-SEKRETASE DER ALZHEIMER KRANKHEIT ?.61
4.3 UNTERSUCHUNGEN ZU BACE1.64
4.3.1 KLONIERUNG VON BACE1 UND HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER GEGEN
DAS ENZYM.64
4.3.2 HERSTELLUNG BACEL-TRANSGENER
DROSOPHILA MELANOGASTER.66
4.4 REKOMBINANTE HETEROLOGE EXPRESSION VON ALZHEIMER-RELEVANTEN GENEN.67
4.4.1 EXPRESSION VON PS2 (-FRAGMENTEN IN) E. COLI.67
4.4.2 EXPRESSION SF9-ZELLEN.68
4.4.3 SF9-ZELLEN - EIN ZELLULAERES MODELLSYSTEM FUER DIE UNTERSUCHUNG VON
SS-
UND Y-SEKRETASE ?.69
4.5 AUSBLICK.70
5 MATERIALIEN. 72
5.1 CHEMIKALIEN.:.72
5.2 MATERIALIEN FUER REKOMBINANTE DNA-EXPERIMENTE.74
5.3 PROTEINE UND MATERIALIEN FUER DIE PROTEINANALYTIK.74
5.4 MATERIALIEN FUER DIE ZELLKULTUR.75
5.5 ZELLLINIEN.75
5.6 BAKTERIENSTAEMME.75
5.7 RADIOCHEMIKALIEN.75
5.8 ENZYME.76
5.9 ANTIKOERPER.76
5.10 PLASMIDE.77
5.11 OLIGONUKLEOTIDE.77
5.13 PEPTIDE.:.79
5.14 GERAETE.79
6 METHODEN.80
6.1 ALLGEMEINE DNA-METHODEN.80
6.1.1 PUFFER UND MEDIEN.,.80
6.1.2 KOMPETENTE BAKTERIENZELLEN.81
6.1.3 HERSTELLUNG ANTIBIOTIKAHALTIGER AGARPLATTEN.81
6.1.4 TRANSFORMATION VON DNA IN E. COLI.81
6.1.5 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN.81
6.1.6 AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSEGELEN.82
6.1.7 AUFREINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN.82
6.1.8 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.83
6.1.9 PRAEPARATION KLEINER DNA-MENGEN (YYMINIPRAEP").83
6.1.10 PRAEPARATION GROSSER DNA-MENGEN (YYMAXIPRAEP").84
N
6.1.11 ETHANOL-FAELLUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN/DNA.85
6.1.12 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.85
6.1.13 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).85
6.1.14 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE.86
6.1.15 BEHANDLUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT KLENOW-POLYMERASE.86
6.1.16 KLONIERUNG DER VERWENDETEN PLASMIDE.87
6.1.17 KLONIERUNG VON BACE1 AUS EINER SH-SY5Y-EINZELSTRANG-CDNA-
BIBLIOTHEK.90
6.1.17.1 EXTRAKTION VON MRNAAUS'ZELLEN.90
6.1.17.2 CDNA-SYNTHESE MIT ZUFALLSHEXAMEROLIGONUKLEOTIDEN.91
6.1.17.3 KLONIERUNG VON BACE1.91
6.2 ALLGEMEINE PROTEIN-METHODEN.92
6.2.1 IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN.92
6.2.1.1 LYSE VON ZELLEN.92
6.2.1.2 IMMUNPRAEZIPITATION NICHT RADIOAKTIV MARKIERTER PROTEINE.93
6.2.1.3 IMMUNPRAEZIPITATION RADIOAKTIV MARKIERTER PROTEINE.93
6.2.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN.94
6.2.2.1 TRIS/TRICIN-GELELEKTROPHORESE.94
6.2.2.2 TRIS/GLYCIN-GELELEKTROPHORESE. 94
6.2.3 YYWESTERN-BLOT".95
6.2.3.1 YYWESTEM-BLOT"-TRANSFER.95
6.2.3.2 YYWESTEM-BLOT"-DETEKTION.96
6.2.3.3 ENTFERNUNG PROTEINGEBUNDENER ANTIKOERPERKOMPLEXE VON
NITROZELLULOSEMEMBRANEN (YYSTRIPPEN").97
6.2.4 GEKOPPELTE IN VITRO TRANSKRIPTION UND TRANSLATION.97
6.2.5 AUTORADIOGRAPHIE VON PROTEINEN.98
6.2.6 ANREICHERUNG VON MEMBRANPROTEINEN DURCH DIFFERENTIELLE
ZENTRIFUGATION.98
6.2.7 DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.99
6.2.7.1 LYSE DER ZELLEN.99
6.2.7.2 DURCHFUEHRUNG DER DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION UND
AUFARBEITUNG DER PROBEN. 99
6.2.8 PRAEZIPITATION VON PROTEINEN MIT TRICHLORESSIGSAEURE.100
6.2.9 ERZEUGUNG POLYKLONALER ANTISEREN.100
6.2.9.1 KOPPLUNG VON PEPTIDEN AN SCHLUESSELLOCHSCHNECKEN-
HAEMOCYANIN (KLH) MIT EDC.100
OE.2.9.2 IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN.101
6.2.9.3 AUFARBEITUNG VON KANINCHEBLUT.101
6.2.10 ECHTZEIT OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ-MESSUNGEN (SPR).101
6.2.10.1 IMMOBILISIERUNG DER PEPTIDE AUF DER CHIPOBERFLAECHE.101
M
6.2.10.2 DURCHFUEHRUNG DER MESSUNGEN ZUR BESTIMMUNG DES
RELATIVEN ANTIKOERPERTITERS.102
6.2.11 KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN VON PROTEINLOESUNGEN MIT HILFE DES
BRADFORD-TESTS.102
6.2.12 KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN VON PROTEINLOESUNGEN MIT HILFE DES
BCA-TESTS.103
6.2.13 INKUBATION MIT BIOTINYLIERTEN INHIBITOREN.103
6.2.14 PEPSTATIN-PULLDOWN.104
6.2.15 COOMASSIE-FAERBUNG VON SDS-PAQE-GELEN.104
6.3 KULTIVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN.105
6.3.1 PUFFER UND ZELLKULTURMEDIEN.105
6.3.2 KULTUR VON ZELLINIEN.105
6.3.2.1 KULTUR VON SAEUGERZELLLINIEN.105
63.2.2 KULTUR VON SF9-ZELLEN.106
6.3.3 TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT CASCPCLL-PRAEZIPITIERTER DNA.106
6.3.4 TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT LIPOFECTAMIR^PLUS.107
6.3.5 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN.107
6.4 EXPRESSION VON PROTEINEN IN E.COLI UND IHRE REINIGUNG.108
6.4.1 PUFFER UND MEDIEN.108
6.4.2 KULTUR DER BAKTERIEN UND INDUKTION DER PROTEINEXPRESSION.109
6.4.3 ERNTE UND AUFSCHLUSS DER BAKTERIEN.109
6.4.4 REINIGUNG DER FUSIONSPROTEINE.109
6.4.5 ABSPALTUNG VON GST MIT ENTEROKINASE.111
6.5 DAS BACULOVIRUS-SYSTEM.111
6.5.1 TRANSPOSITION DES ZU EXPRIMIERENDEN GENS IN DAS VIRUSGENOM.111
6.5.2 PRAEPARATION DER VIRUS-BACMID-DNA AUS E. COLI.111
6.5.3 TRANSFEKTION VON SF9-ZELLEN MIT REKOMBINANTER BACMID-DNA.112
YY
6.5.4 AMPLIFIKATION, ERNTE UND LAGERUNG REKOMBINANTER BACULOVIREN.112
6.5.5 INFEKTION VON SF9-ZELLEN ZUR EXPRESSION VON PROTEINEN IN GROESSEREM
MASSSTAB.113
6.6 SYNTHESE DER BIOTINYLIERTEN INHIBITOREN.113
6.6.1 SYNTHESE VON (6'(BIOTINAMIDO)-6-HEXANAMIDOHEXANOAT)-STATIN
(6).113
6.6.2 SYNTHESE VON (6'(BIOTINAMIDO)-6-HEXANAMIDOHEXANOAT)-LEUCIN-
LEUCIN-LEUCINAMID (7).114
6.6.3 VERSUCH DER SYNTHESE VON LEUCIN-LEUCIN-LEUCINAL (3).114
6.6.4 SYNTHESE VON PEPSTATIN A-BIOTIN (10).115
7 ZUSAMMENFASSUNG.117
8 LITERATURVERZEICHNIS. .119
9 ABKUERZUNGEN. 126
IV |
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