Engineering von Kobravenomfaktor(CVF)-Fusionsproteinen zur Komplement-vermittelten Lyse von Tumorzellen:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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| Beschreibung: | Hamburg, Univ., Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
ABKUERZUNGEN
4
I.
EINLEITUNG
7
1.
DAS
NEUROBLASTOM
UND
IMMUNOTHERAPIE
7
2.
DAS
KOMPLEMENTSYSTEM
UND
DER
KOBRA
VENOM
FAKTOR
(CVF)
8
3.
ANTIKOERPER
UND
ANTIKOERPERFRAGMENTE
12
4.
EXPRESSIONSSYSTEME
15
5.
AUFGABENSTELLUNG
19
II.
MATERIAL
20
1.
ALLGEMEINE
MATERIALIEN
20
1.1
CHEMIKALIEN
20
1.2
ANTISEREN
UND
ANTIKOERPERLOESUNGEN
20
1.3
ENZYME
21
1.4
OLIGONUKLEOTIDE
21
2.
PUFFER
UND
MEDIEN
22
III.
METHODEN
28
1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
28
1.1
BAKTERIENZELLKULTUREN
28
1.2
HEFEZELLKULTUREN
28
1.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
2
ML-KULTUREN
(MINIPREP)
28
1.4
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
10
ML-KULTUREN
(MIDIPREP)
29
1.5
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
100
ML-KULTUREN
(MAXIPREP)
29
1.6
DAS
PICHIA
PARTORIS-PROTEINEXPRESSIONSSYSTEM
30
1.7
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
HEFE
34
1.8
TRANSFORMATION
VON
PICHIA
PASTORIS
35
INHALTSVERZEICHNIS
1.9
DASBACULOVIRUS-PROTEINEXPRESSIONSSYSTEM
36
1.10
ISOLIERUNG
VON
BACULOVIRUS-DNA
38
1.11
LINEARISIERUNG
VON
BACULOVIRUS-DNA
39
1.12
DIE
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
39
1.13
DNA-MODIFIKATION
(RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
UND
ABBAUREAKTION)
43
1.14
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
43
1.15
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
43
1.16
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
44
1.17
DEPHOSPHORYLIERUNG
UND
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
44
1.18
HERSTELLUNG KOMPETENTER
ZELLEN
VON
E.
COLI
45
1.19
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
45
1.20
DNA-SEQUENZIERUNG
46
1.21
ISOLIERUNG
VON
LOW-COPY
PLASMID-DNA
(PCANTAB5E)
47
1.22
ISOLIERUNG
VON
SSDNA
AUS
KULTURFIBERSTAND
48
1.23
PROTEINEXPRESSION
IN
PICHIA
PASTORIS
48
1.24
AUFREINIGUNG
VON
HIS-T
AG-FUSIONSPROTEINEN
48
1.25
INSEKTENZELLKULTUR
49
1.26
AUFBEWAHRUNG
VON
INSEKTENZELLEN
49
1.27
TRANSFEKTION
VON
SF9-ZELLEN
50
1.28
PLAQUE
ISOLIERUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
50
1.29
AMPLIFIKATION
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
51
1.30
TITERBESTIMMUNG
51
1.31
HERSTELLUNG
VON
WTLACZ-VIRUS
52
1.32
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
IN
INSEKTENZELLEN
52
1.33
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEN
SCFV-CVF-KONSTRUKTEN
53
1.34
PROTEINEXPRESSION
IN
CHO-ZELLEN
54
2.
ZELLKULTUR
56
2.1
DAUERKULTUR
56
2.2
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
57
2.3
EINFRIEREN,
AUFTAUEN
UND
LAGERUNG
VON
ZELLEN
57
3.
PROTEINCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
57
3.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE)
57
3.2
COOMASSIE-BRILLANT-BLAU-FAEIBUNG
VON
PROTEINBANDEN
58
3.3
SILBEMITRATFAERBUNG
VON
PROTEINBANDEN
58
3.4
TROCKNEN
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
59
3.5
ULTRAFILTRATION
VON
EXPRESSIONSUEBERSTAENDEN
59
3.6
WESTERN-BLOT
59
3.7
COOMASSIE-BRILLANT-BLAU-FAERBUNG
VON
BLOT-MEMBRANEN
59
3.8
IMMUNOPRINTING
VON
PROTEINBANDEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
59
3.9
ELISA
(ENZYRN
LINKED
IMMUNOSOTBENT
ASSAY)
60
4.
KOMPIEMENTMETHODEN
62
4.1
HAEMOLYTISCHER
TEST
FUER
KOBRAFAKTOR
62
4.2
KOMPLEMENT-VERBRAUCHSTEST
63
4.3
KOMPLEMENT-ZYTOTOXIZITAETSTEST
64
2
INHALTSVERZEICHNIS
IV.
ERGEBNISSE
67
1.
KLONIERUNG
DES
RSCFV704-FRAGMENTES
67
2.
KLONIERUNG
VON
RSCFV704-CVF-KONSTRUKTEN
IN
PVL1393
75
2.1
KLONIERUNG
VON
PVL1393-SCFV704-CVF
N
'
"
RMIML
75
2.2
KLONIERUNG
VON
PVL1393-SCFV704-CVF
HIS
75
2.3
KLONIERUNG
VON
PVL1393-SCFV704-CVF
C
'
"
RAI,,D
78
3.
KLONIERUNG
VON
STREPTAVIDIN-CVF
IN
PCDNA3
81
4.
PROTEINEXPRESSION
DES
SCFV704-FRAGMENTES
84
5.
PROTEINEXPRESSION
VON
RSCFV-CVF-KONSTRUKTEN
87
5.1
TRANSFEKTION
UND
EXPRESSION
DER
RSCFV-CVF-KONSTRUKTE
IN
SF9-ZELLEN
87
5.2
EXPRESSION
VON
PVL1393-SCFV704-CVF
N
'
TENIN
'
1
,
PVL1393-SCFV704
CVF
H
,
S
UND
PVL1393-SCFV704-CVF
C
'
,ENNINAL
IN
SF9-ZELLEN
88
6.
PROTEINEXPRESSION
DES
STREPTAVIDIN-CVF-KONSTRUKTES
95
7.
CHARAKTERISIERUNG
DER
IN
INSEKTENZELLEN
EXPRIMIERTEN
RSCFV-CVF-KONSTRUKTE
98
7.1
CVF-AKTIVITAETSNACHWEIS
DER
REKOMBINANTEN
RSCFV704-CVF-KONSTRUKTE
98
7.2
BINDUNGSSTUDIEN
DER
REKOMBINANTEN
SCFV704
UND
SCFV704-CVF
KONSTRUKTE
MITTELS
ELISA
UND
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
100
7.3
DIE
UNTERSUCHUNGEN
DER
KOMPLEMENTLYSE
DES
REKOMBINANTEN
SCFV
CVF-KONSTUKTES
VON
HUMANEN
NEUROBLASTOMZELLEN
104
8.
CHARAKTERISIERUNG
VON
IN
CHO-ZELLEN
EXPRIMIERTEM
STREPTAVIDIN-CVF
106
8.1
DIE
UNTERSUCHUNG
DER
BINDUNG
ZWISCHEN
DEM
REKOMBINANTEN
STREPTAVIDIN-CVF
FUSIONSPROTEIN
UND
BIOTIN
106
8.2
CVF-AKTIVITAETSNACHWEIS
DES
REKOMBINANTEN
STREPTAVIDIN-CVF
FUSIONSPROTEIN
107
V.
DISKUSSION
109
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
118
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
121
3 |
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