Charakterisierung des Iral-Operons der Gruppe-A-Streptokokken:
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2001
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| adam_text | Titel: Charakterisierung des Iral-Operons der Gruppe-A-Streptokokken
Autor: Bücken, Elke
Jahr: 2001
1. Einleitung .V 7
1.1. Bakteriologische und serologische Einordnung von S.7
Streptococcus pyogenes
1.2. Klinische Bedeutung von Streptococcus pyogenes S.7
1.2.1. Vorkommen
1.2.2. Typische durch Streptococcus pyogenes hervorgerufene Krankheitsbilder
1.2.3. Prädisponierende Faktoren und Epidemiologie von GAS-Infektionen
1.3. Wichtige Virulenzfaktoren der GAS S.10
1.4. Lipoproteine in Bakterien Sil
1.5. Lipoproteine als Bestandteile von ABC-Transportern Sil
1.6. Aufgabenstellung S. 12
2. Material und Methoden 5 13
2.1. Materialien 5 13
2.1.1. Bakterienstämme S. 13
2.1.2. Vektoren S. 13
2.1.2.1. Der pFW5-Vektor
2.1.2.2. Der pFW6-Vektor
2.1.2.3. Der Lambda-ZAP-Express-Vektor
2.1.3. Bakteriologische Kulturmedien S. 14
2.1.4. Enzyme, Chemikalien und Standardlösungen S. 16
2.1.5. Geräte und Computerprogramme S. 18
2.2. Methoden S. 20
2.2.1. Kultivierung und Aufbewahrung von Bakterienstämmen und S 20
Phagensuspensionen
2.2.2. Propagierung und Identifikation rekombinanter Lambda-Phagen S. 21
2.2.2.1. Infektion von E.coli Wirtsbakterien mit Lambda-ZAP-Express-Phagen (Lambda-Infektion)
2.2.2.2. Plaquelifting
2.2.3. Präparation von DNA s¦ 24
2.2.3.1. Präparation genomischer DNA aus Streptokokken
2.2.3.2. Präparation von Plasmid-DNA aus E.coli
2.2.3.2.1. Minipräparation von Plasmid-DNA
2.2.3.2.2. Maxipräparation von Plasmid-DNA
2.2.3.2.3. QlAprep Spin Plasmid Kit
2.2.4. Aufreinigung von DNA S28
2.2.4.1. Cäsiumchlorid-bichtegradientenzentrifugation von DNA
2.2.4.2. Wizard DNA clean up -Reinigung von DNA
2.2.4.3. QIAquick Spin -Reinigung von PCR-Produkten
2.2.5. Isolierung von Gesamt-RNA aus Streptokokken s-31
2.2.6. Synthese und Aufbereitung von Oligonukleotiden S.34
2.2.7. Konzentrationsbestimmung Nukleinsäure-haltiger Losungen S. 35
2.2.8. Restriktionsenzymanalyse von DNA *5
2.2.9. Agarosegelelektrephorese von DNA ^ ^°
2.2.10. Elektrophorese von RNA in denaturierenden Agarosegelen S. 37
2.2.11. Nukleinsäure-Biotting Verfahren S. 39
2.2.11.1. Kolonie-Blotfur£.co/i
2.2.11.2. Southern-Blot im Vakuum-Blot Verfahren
2.2.11.3. Northern-Biot im Vakuum-Blot Verfahren
2.2.12. Markierung von Nukleinsäuren S. 42
2.2.13. Hybridisierungsreaktionen S. 43
2.2.14. Polymerase-Kettenreaktion S. 45
2.2.15. DNA-Klonierung S. 47
2.2.15. i. Generierung und Reinigung der zu klonierenden DNA-Fragmente sowie
der Vektor-DNA
2.2.15.2. DNA-Ligation
2.2.16. Herstellung und Transformation kompetenter E.coli-Zeüen ß.49
2.2.17. Herstellung und Elektroporation kompetenter S. 50
Streptokokken-Zellen
2.2.18. Nicht-radioaktive, halb-automatische DNA-Sequenzierung S. 52
2.2.18.1. Herstellung des Sequenzierungsansatz im Cycle-Sequencing -Verfahren
2.2.18.2. Aufbereitung des Sequenzierungsansatzes
2.2.18.3. Herstellung eines 7%igen Polyacrylamidgeles für die DNA-Sequenzierung
2.2.18.3.1. Vorbehandlung der Glasplatten
2.2.18.3.2. Herstellung des 7%igen Polyacrylamidgeles
2.2.18.4. Poly acrylamidgelelektrophorese
2.2.19. Funktionstestungen S. 56
2.2.19.1. Klassischer Phagozytoseresistenztest
2.2.19.2. Wachstumskurven
2.2.19.3. Bestimmung der MHK (Minimale Hemm-Konzentration)
3. Ergebnisse s. 58
3.1. Sequenzierung des Operons downstream des v/r-Regulons .V 58
von Streptococcus pyogenes Serotyp M49
3.1.1. Darstellung und Analyse der GAS /ra-Operon Sequenz und ..downstream S 59
angrenzender Bereiche
3.2. Vorkommen des /ra/-Genombereiches in GAS verschiedener S. 65
Serotypen
3.3. RNA-Analyse des potentiellen /ro/-Operons S. 66
3.4. Mutagenesen im sequenzierten Abschnitt S 66
3.5. Erfolgsnachweis der Mutation mittels Restriktionsenzymanalyse S. 68
3.6. Funktionstestungen der Mutanten im Vergleich zum Wildtyp
3.6.1. Wachstumskurven unter Zusatz von Calciumkationen
3.6.2. Bestimmung der maximalen Wachstumsdichte in Gegenwart und
Abwesenheit von Verapamil und unter Verwendung verschieden
konzentrierter divalenter Kationen
3.6.3. Keimwachstum unter Zusatz von Chelatoren zum THY-Medium
3.6.4. Phagozytoseresistenzbestimmung
3.7. RNA-Analyse der Mutanten S. 87
4. Diskussion S. 88
5. Zusammenfassung .S . 92
6. Literaturverzeichnis S. 94
S.70
S. 71
S 76
S. 83
S.86
Anhang
I. Positionen und Basensequenzen der verwendeten Primer S. 98
II. Abkürzungsverzeichnis S- 100
Danksagung S. 102
Lebenslauf S. 103
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