Vergleich der zwei im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Titrationsmethoden für das Virus der aviären Encephalomyelitis, der Titration im embryonierten Hühnerei und der Titration auf Zellkulturen, mit einem neuen, für den quantitativen Nachweis dieses Virus entwickelten indirekten ELISA:
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Autor: Langhardt, Anja
Jahr: 2001
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG.................................1
2 LITERATUR..........................................................................................3
2.1 Die Aviäre Encephalomyelitis (AE) des Huhnes ...........................3
2.1.1 Einleitung.................................................................................................3
2.1.2 Geschichtlicher Oberblick zur AE...........................................................4
2.1.3 Taxonomie des AEV................................................................................4
2.1.4 Morphologie des AEV.............................................................................6
2.1.5 Physikalisch-chemische Eigenschaften des AEV....................................6
2.1.6 Wirtschaftliche Bedeutung der AE..........................................................7
2.1.7 Impfmaßnahmen gegen die AE...............................................................8
2.1.7.1 Impfstoffe gegen die AE...........................................................................8
2.1.8 Epidemiologie der AE...........................................................................10
2.1.9 Symptomatologie der AE.......................................................................14
2.1.9.1 Natürliche AEV-Infektion......................................................................14
2.1.9.2 Experimentelle AEV-Infektion...............................................................15
2.! .9.2.1 Experimentelle AEV-Infektion zur Erfüllung der Henle-Koch schen
Postulate.........................................................................................................15
2.1.9.2.2 Experimentelle AEV-Infektion zur Wirksamkeitsprüfung der Impfstoffe.... 17
2.1.10 Pathologie der AE..................................................................................17
2.1.10.1 Pathologisch-anatomische Veränderungen...........................................77
II Inhaltsverzeichnis
2.1.10.2 Palhologisch-histologische Veränderungen..........................................18
2.1.11 Diagnose der Erkrankung......................................................................19
2.1.11.1 Erregernachweis durch Virusanzüchtung im Hühnerei........................19
2.1.11.2 Verimpfung des Erregers in Hühnergehirne.........................................20
2.1.11.3 Elektronenmikroskopischer Nachweis des AEV....................................20
2.1.12 Serologische Methoden für den AEV- und Antikörpernachweis..........21
2.1.12.1 Serumneutralisation (SN) im bebrüteten Hühnerei...............................21
2.1.12.2 Embryoempfänglichkeitstest (EET) bei Zuchtherden............................21
2.1.12.3 Agargel-Präzipitation (AGP).................................................................22
2.1.12.4 Komplementbindungsreaktion (KBR)....................................................23
2.1.12.5 Passiver Hämagglutinaüonstest (PHA).................................................24
2.1.12.6 Direkte Immunfluoreszenz (DIF)...........................................................25
2.1.12.7 Indirekte Immunfluoreszenz (HF)..........................................................25
2.1.12.8 Indirekte Immunfluoreszenz mit Hühnerembryogehirn-Zellkulturen....25
2.1.12.9 Enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA)......................................27
2.1.12.9.1 AEV-Antikörper-ELISA..........................................................................28
2.1.12.9.2 AEV-ELISA............................................................................................30
2.1.12.9.3 Nicht-kompetitiver ELISA........................................................................32
2.1.12.9.4 Kompetitiver ELISA................................................................................36
2.2 Quantitativer AEV-Nachweis gemäb European
Pharmacopceia.....................................................................................37
2.3 Fragestellungen der eigenen Untersuchungen...........................37
Inhaltsverzeichnis III
3 MATERIAL UND METHODEN.......................................................39
3.1 Material..............................................................................................39
3.1.1 SPF-Eier.................................................................................................39
3.1.2 Tiere.......................................................................................................40
3.1.2.1 Hühner...................................................................................................40
3.1.2.2 Kaninchen..............................................................................................41
3.1.3 Zellkulturen............................................................................................42
3.1.3.1 Hühnerembryogehirn-Zellkultur (CEB)................................................42
3.1.3.2 Hühnerembryofibroblasten-Kullnr(HEF).............................................42
3.1.4 Viren......................................................................................................43
3.1.4.1 Impfstoffe...............................................................................................43
3.1.4.1.1 Nobilis^AE 1143, Intervet.......................................................................43
3.1.4.1.2 TAD* AE vac, LAH.................................................................................44
3.1.4.1.3 AEV-Titrationsstandard, Intervet..............................................................45
3.1.4.1.4 Nobilis* Duck Hepatitis, Intervet .............................................................45
3.1.4.2 AdjiivansDüuvac Forte, Intervet.......................................................46
3.1.4.3 AEVStammvan Roekel.........................................................................46
3.1.4.3.1 AEV-Stamm va» Roekel 76-1, Intervet......................................................46
3.1.4.3.2 AEV-Stamm van Roekel 37020, LAH.......................................................47
3.1.4.4 Eigene Viruszüchtungen........................................................................47
3.1.4.4.1 Viruszüchtung mit dem AEV-Stamm Calnek 1143....................................47
IV Inhaltsverzeichnis
3.1.4.4.2 Viruszüchtung mit dem AEV-Stamm van Roekel.......................................48
3.1.4.4.3 ELISA-Negativkontrolle...........................................................................48
3.1.5 Seren......................................................................................................48
3.1.5.1 Enzymgekoppeltes AEV-Antiserum vom Huhn......................................49
3.1.5.2 Enzymgekoppeltes AEV-Antiserum vom Kaninchen..............................49
3.1.6 Lösungen und Agenzien für virologische und serologische
Untersuchungen....................................................................................50
3.1.7 AEV- Antikörper-ELISA FlockChek®, IDEXX GmbH........................55
3.2 Methoden.............................................................................................56
3.2.1 Versuchsbeschreibung...........................................................................56
3.2.2 Haltung und Immunisierung der Versuchstiere.....................................56
3.2.2.1 Haltung und Immunisierung der Hühner..............................................56
3.2.2.2 Haltung und Immunisierung der Kaninchen.........................................58
3.2.3 Probennahme.........................................................................................60
3.2.3.1 Blutentnahme bei Hühnern....................................................................60
3.2.3.2 Blutentnahme bei Kaninchen.................................................................60
3.2.4 Herstellung von Negativ- und AEV-Positivseren..................................61
3.2.4.1 Herstellung von Negativseren aus Hühnerblut......................................61
3.2.4.2 Herstellung von AEV-Positivseren aus Hühnerblut..............................61
3.2.4.3 Herstellimg von Negativseren aus Kaninchenblut................................62
3.2.4.4 Herstellung von AEV-Positivseren aus Kaninchenblut........................62
Inhaltsverzeichnis
3.2.4.5 Herstellung von Kaninchen-Poolserum für den AEV-ELISA................62
3.2.5 Anzüchtung des AE-Virus.....................................................................63
3.2.6 ELISA-Negativkontrolle........................................................................65
3.2.7 Virustitration in embryonierten SPF-Hühnereiern.................................66
3.2.7.1 Titerbestimmung nach Reed und Muench (lineare Interpolation).....66
3.2.7.2 Titerbestimmung nach SpeäRMAN und KAERBER (Flächenintegral).......68
3.2.7.3 Titration des AEV-Stammes Calnek 1143 (Impfstamm)........................69
3.2.7.4 Titration des AEV-Stammes van Roekel (Challengestamm).................70
3.2.8 Virustitration auf Zellkulturen...............................................................71
3.2.8.1 Herstellung von Hühnerembryogehirn-Zellkulturen (CEB)..................71
3.2.8.2 Herstellung von Hühnerembryofibroblasten-Kulturen (HEF)..............72
3.2.8.3 Beimpfung der CEB-Zellkulturen und der HEF-Kulturen mit AEV......72
3.2.8.4 Durchführung der Immunfluoreszenz....................................................73
3.2.9 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).....................................74
3.2.9.1 Antikörper-ELISA für Hühnerseren.......................................................74
3.2.9.1.1 Durchführung des kommerziellen ELISA-Testkits mit Hühnerseren.............74
3.2.9.2 Antikörper-ELISA für Kaninchenseren..................................................75
3.2.9.3 ELISA für das AE-Virus.........................................................................76
3.2.9.3.1 Beschichtung der ELISA-Platten mit AE-Virus.............................................76
3.2.9.3.2 Durchführung des indirekten AEV-ELISA.................................................77
VI Inhaltsverzeichnis
4 ERGEBNISSE......................................................................................80
4.1 Titrationen im embryonierten Hühnerei........................................80
4.1.1 AEV-bedingte Embryoveränderungen...................................................80
4.1.2 AEV-bedingte Symptome bei Küken....................................................81
4.1.3 Titration des AEV-Impfstammes Calnek 1143.....................................83
4.1.3.1 Titration der AEV-Impfstoffchargen der Firma LAH............................84
4.1.3.1.1 Titerberechnung TAD®AEvac Ch.-B.: 960680.........................................87
4.1.3.1.2 Titerberechnung TAD® AE vac Ch.-B.: 975998.........................................88
4.1.3.2 Titration der AEV-Impfstoffchargen der Firma Intervet.......................91
4.1.3.2.1 TiterberechnungNobilis® AE 1143 Ch.-B.: 70672-1-5...............................94
4.1.3.2.2 Titerberechnung Nobilis® AE 1143 Ch.-B.: 70411-1-4...............................95
4.1.4 Titration des embryoadaptierten AEV-Stammes van Roekel...............98
4.1.4.1 Titration des AEV-Stammes van Roekel 37020 (LAH)........................99
4.1.4.2 Titration des AEV-Stammes van Roekel 76-1 (Intervet)....................101
4.1.5 Übersicht der Titrationsergebnisse im embryonierten SPF-Hühnerei..l03
4.2 Titrationen in Zellkulturen..........................................................104
4.3 EntwicklungErNESquantitativen ELISA s fürdasAEV..........105
4.3.1 Serumantikörper..................................................................................106
4.3.1.1 AEV-Antikörpertiter der Hühnerseren................................................106
4.3.1.2 AEV-Antikörpertiter der Kaninchenseren...........................................107
4.3.2 Vergleich zwischen Hühner- und Kaninchenseren bei der
Entwicklung eines ELISA s für das AEV............................................110
4.3.3 Vergleich verschiedener ELISA-Methoden.........................................113
Inhaltsverzeichnis VII
4.3.3.1 Indirekter EL1SA..................................................................................113
4.3.3.2 Capture-ELISA....................................................................................118
4.3.4 Vergleich verschiedener ELISA-Konjugate .......................................118
4.3.5 Überprüfung der Spezifität des AEV-ELISA s....................................119
4.3.6 ELISA mit acht AEV-Impfstoffchargen und Vergleich mit dem
AEV-Titrationsstandard.......................................................................120
5 DISKUSSION.....................................................................................124
5.1 Titrationen im embryonierten Höhnerei.....................................124
5.2 Titrationen in Zellkulturen..........................................................128
5.3 ELISA...................................................................................................130
5.3.1 Entwicklung eines ELISA s für das AEV...........................................130
5.3.2 Validierung des indirekten ELISA s....................................................133
5.3.3 Titrationen von Impfstoffen im indirekten ELISA..............................134
5.4 Fazit....................................................................................................135
6 ZUSAMMENFASSUNG...................................................................137
7 SUMMARY........................................................................................139
8 LITERATURVERZEICHNIS.........................................................141
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