Erzeugung und phänotypische Analyse einer HNK-1-Sulfotransferase-knock-out-Maus:
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2001
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INDEX
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
I
SUMMARY
N
EINLEITUNG
1
1
STRUKTUR
DES
HNK-1-KOHLENHYDRATES
2
2
EXPRESSION
DES
HNK-1-KOHLENHYDRATES
2
3
MOEGLICHE
FUNKTIONEN
DES
HNK-1-KOHLENHYDRATES
IM
NERVENSYSTEM
3
4
BIOSYNTHESE
DES
HNK-1-KOHLENHYDRATES
6
5
DIE
HNK-L-SULFOTRANSFERASE
7
6
FUNKTIONEN
VERSCHIEDENER
SULFOTRANSFERASEN
8
MATERIAL
UND
METHODEN
11
1
VERWENDETE
REAGENTIEN
UND
LOESUNGEN
11
1.1
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
ZELLKULTURMEDIEN
11
1.2
NAEHRMEDIEN
11
1.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
12
1.4
ANTIKOERPER
12
1.5
OLIGONUCLEOTIDE
13
2
DURCHSUCHEN
EINER
X-BAKTERIOPHAGEN-BIBLIOTHEK
13
2.1
AUSPLATTIEREN
VON
AE-PHAGEN
UND
HERSTELLUNG
DER
REPLIKAFILTER
13
2.2
HYBRIDISIERUNG
VON
REPLIKAFILTEM
MIT
EINER
[A
32
P]-DCTP
MARKIERTEN
SONDE
13
2.3
ISOLIERUNG
DER
PLAQUES
UND
PRAEPARATION
DER
PHAGEN-DNA
14
2.4
KONSTRUKTION
REKOMBINANTER
PLASMIDE
14
25
IDENTIFIZIERUNG
UND
ANALYSE
DES
PHAGENINSERTS
14
3
ZELLKULTUR
15
3.1
FIBROBLASTENKULTUR
16
3.2
KULTIVIERUNG
EMBRYONALER
STAMMZELLEN
(ES-ZELLEN)
16
4
ERZEUGUNG
VON
GEZIELTEN
KNOCK
OUR-MAEUSEN
16
4.1
KONSTRUKTION
DES
TARGETING-V
EKTORS
17
4.2
DNA-TRANSFER
IN
ES-ZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION
18
4.3
SELEKTION
DER
ES-ZELLEN
18
4.4
GEWINNUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
ES-ZELLEN
19
4.5
NACHWEIS
VON
HOMOLOGEN
ES-ZELLREKOMBINANTEN
MIT
HILFE
DER
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
19
4.6
INJEKTION
VON
ES-ZELLEN
UND
DER
EMBRYOTRANSFER
20
5
PRAEPARATTON
VON
BIOPSIEMATERIAL
FUER
DIE
MULTIPLEX-PCR
20
INDEX
6
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
21
6.1
PROTEINEXTRAKTION
FUER
DIE
SDS-PAGE
21
6.2
DURCHFUEHRUNG
DER
SDS-PAGE
21
6.3
SILBERFAERBUNG
21
7
IMMUNOBLOT-ANALYSE
21
8
HISTOLOGIE
22
8.1
PRAEPARATION
VERSCHIEDENER
ORGANE
FUER
DIE
LICHT
UND
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
22
8.2
KUNSTSTOFFEINBETTUNG
DER
SEMIDUENNSCHNITTE
UND
ULTRADUENNSCHNITTE
22
8.3
SCHNITTECHNIKEN
23
9
IMMUNCYTOCHEMIE
23
9.1
IMMUNLOKALISATION
AN
PERFUNDIERTEN
SCHNITTEN
23
9.2
IMMUNLOKALISATION
AN
KRYOSCHNITTEN
23
10
VERHALTENSBIOLOGISCHE
VERSUCHE
24
10.1
VERSUCHSTIERE
UND
EXPERIMENTELLE
BEDINGUNGEN
24
10.2
OPEN
FIELD-TEST
25
10.3
ROTAROD-TEST
25
10.4
POLE-TEST
26
10.5
WIRE
HANGING-TEST
26
10.6
MORRIS
WATER
MAZE-TEST
26
10.7
ELEVAIED
PLUS-MAZE-TEST
27
10.8
LIGHT-DARK
AVOIDANCE-TEST
28
10.9
STATISTIK
29
ERGEBNISSE
30
1
ERZEUGUNG
EINER
HNK-L-SULFOTRANSFERASE
KNOCK
OUT-MAUS
30
1.1
ISOLIERUNG
DES
HNK-L-SULFOTRANSFERASE-GENES
30
1.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
ST-GENES
31
1.3
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
FUER
DAS
GENE-TARGETING
DES
SR-GENES
33
1.4
ISOLIERUNG
VON
ZWEI
REKOMBMANTEN
ES-ZELLKLONE
35
1.5
GENERIERUNG
CHIMAERER
MAEUSE
AUS
DEN
REKOMBINIERTEN
ES-ZELLKLONEN
UND
ERZEUGUNG
VON
HOMOZYGOTEN
ST-MUTANTEN
36
1.5.1
BLASTOCYSTENTRANSFER
ZUR
HERSTELLUNG
CHIMAERER
MAEUSE
36
1.5.2
NACHWEIS
DES
MUTIERTEN
SR-ALLELS
IN
CHIMAEREN
UND
HETEROZYGOTEN
DURCH
PCR
37
1.5.3
VERPAARUNG
DER
CHIMAEREN
UND
HETEROZYGOTEN
ZUR
ERZEUGUNG
VON
KNOCK
OUZ-MAEUSEN
37
2
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
ST-KNOCK
OUT-MAUS
38
2.1
BIOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
EXTRAKTEN
AUS
ST-KNOCK
OUZ-MAEUSEN
IM
IMMUNOBLOT
38
2.1.1
ANALYSE
VON
GEHIMHOMOGENATEN
SIEBEN
TAGE
ALTER
MAEUSE
38
II
INDEX
2.1.2
ANALYSE
VON
GEHIMHOMOGENATEN
ZU
VERSCHIEDENEN
ZEITPUNKTEN
DER
ENTWICKLUNG
39
2.1.3
ANALYSE
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
VERSCHIEDENEN
ORGANEN
41
2.2
DAS
MAKROSKOPISCHE
ERSCHEINUNGSBILD
DER
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE
IST
NORMAL
42
2.3
HISTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
VON
GEWEBE
AUS
ST-KNOCK
OUT
MAEUSEN
43
2.3.1
HISTOLOGIE
NICHT-NEURALER
ORGANE
43
2.3.2
HISTOLOGISCHE
UND
IMMUNHISTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
DES
NERVENSYSTEMS
43
2.4
VERHALTENSBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
VON
ST-KNOCK
OUT-MAEUSEN
50
2.4.1
LOKOMOTION
UND
MOTORIK
DER
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE.
50
2.4.2
ANALYSE
DES
RAEUMLICHEN
LEMVERMOEGENS:
MORRIS
WATER
MAZE-TEST
54
2.4.3
AENGSTLICHKEITSVERHALTEN
DER
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE
56
2.5
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
ANALYSEN
DER
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE:
MESSUNGEN
VON
SYNAPTISCHER
AKTIVITAET
UND
LANGZEITPOTENZIERUNG
60
DISKUSSION
63
1
KONSTRUKTION
EINER
HNK-1
SULFOTRANSFERASE-DEFIZIENTEN
MAUS
63
2
DIE
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE
ZEIGEN
KEINE
NACHWEISBARE
SULFATIERUNG
DES
HNK-L-KOHLENHYDRATEPITOPES,
ENTWICKELT
SICH
NORMAL
UND
SIND
FERTIL
66
3
DIE
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE
SIND
MORPHOLOGISCH
NORMAL
67
4
DIE
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE
ZEIGEN
EINE
ERHOEHTE
SYNAPTISCHE
AKTIVITAET
UND
EINE
VERRINGERTE
LANGZEITPOTENZIERUNG
69
5
DIE
ST-KNOCK
OUT-MAEUSE
ZEIGEN
VERAENDERTE
VERHALTENSBIOLOGISCHE
LEISTUNGEN
71
6
GIBT
ES
EINE
KOMPENSATION
DES
SULFATIERTEN
HNK-L-KOHLENHYDRATES
DURCH
STRUKTURELL
VERWANDTE
OLIGOSACCHARIDE?
74
ANHANG
76
REFERENZEN
89
ABKUERZUNGEN
102
DANKSAGUNG
103
LEBENSLAUF
104
III |
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