Funktionelle Charakterisierung der Signaltransduktionskaskade des LFA-1-Integrins:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
2001
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG.1
2 EINLEITUNG.3
2.1 FUNKTION VON T-LYMPHOZYTEN BEI DER IMMUNANTWORT.3
2.2 MECHANISMEN ZUR AKTIVIERUNG VON T-LYMPHOZYTEN.5
2.3 BEDEUTUNG AKZESSORISCHER REZEPTOREN FUER DIE T-ZELL-AKTIVIERUNG.8
2.4 ALLGEMEINE FUNKTIONEN DES LFA-L-INTEGRINS.11
2.5 COSTIMULATORISCHER BEITRAG DES LFA-1 -INTEGRINS.13
2.6 ZIELSETZUNG.15
3 MATERIAL & METHODEN.17
3.1 SPEZIELLE MATERIALIEN.17
3.1.1 GERAETE.17
3.1.2 CHEMIKALIEN.17
3.1.3 ENZYME FUER MOLEKULARBIOLOGIE.18
3.1.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE HILFSMITTEL.18
3.1.5 LOESUNGEN UND PUFFER.19
3.1.6 DNA- UND MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS.19
3.1.7 OLIGONUKLEOTIDE.20
3.1.8 ANTIKOERPER.
/
YY
.21
3.1.9 PLASMIDE.21
3.1.10 BAKTERIENSTAEMME.22
3.1.11 EUKARYONTISCHE ZELLINIEN.22
3.2 KULTIVIERUNG UND STAMMHALTUNG DER VERWENDETEN ORGANISMEN.23
3.2.1 ADHAERENTE SAEUGERZELLEN.24
3.2.2 SUSPENSIONSZELLEN.25
3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN.25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI MITTELS ALKALISCHER LYSE.25
3.3.2 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI IM MG-MASSSTAB.26
3.3.3 ETHANOLFAELLUNG VON DNA.28
3.3.4 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.28
3.3.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ZUR AMPLIFIKATION VON
DNA-FRAGMENTEN.29
3.3.6 PCR-MUTAGENESE.30
3.3.7 ENZYMATISCHE SPALTUNG VON DNA.30
3.3.8 ENTFERNUNG UEBERHAENGENDER DNA-ENDEN.32
3.3.9 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5 '-DNA-ENDEN.32
3.3.10 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON DNA.32
3.3.11 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE UND LIGATION.33
3.3.12 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER
E. COLI MITTELS CACL2.35
3.3.13 TRANSFEKTION VON COS7-ZELLEN MITTELS DEAE-DEXTRAN.36
3.3.14 CALCIUM-PHOSPHAT-TRANSFEKTION VON CV-1 ZELLEN.37
3.3.15 TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLINIEN MITTELS ELEKTROPORATION.38
3.3.16 HERSTELLUNG UND INFEKTION MIT REKOMBINANTEN VACCINIA-VIREN.39
3.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.41
3.4.1 HERSTELLUNG BAKTERIELLER FUSIONSPROTEINE.41
3.4.2 GESAMTZELLYSATE EUKARYOTISCHER ZELLEN.43
3.4.3 ISOLIERUNG VON MEMBRANSUBKOMPARTIMENTEN DURCH FRAKTIONIERUNG.43
3.4.4 IMMUNPRAEZIPITATION.44
3.4.5 SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).45
3.4.6 COOMASIE-BLAU-FAERBUNG VON SDS-PAA-GELEN ZUM NACHWEIS DER
PROTEINE.47
3.4.7 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD.47
3.4.8 WESTEMBLOT-ANALYSE.48
3.5 IMMUNOHISTOCHEMIE.49
3.5.1 IMMUOFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE.49
3.5.2 DURCHFLUSSZYTOMETRIE.49
3.6 T-ZELL-FUNKTIONSANALYSEN.50
3.6.1 PROMOTORAKTIVIERUNGSSTUDIEN.50
3.6.2 BESTIMMUNG INTRAZELLULAERER CALCIUMKONZENTRATIONEN.50
3.6.3 ANALYSE DER ZELLADHAESION AUF ICAM.51
3.6.4 ZYTOLYSE-EXPERIMENTE
52
4 ERGEBNISSE
53
4.1 LFA-1 VERMITTELTE AKTIVIERUNG DES IL-2-PROMOTORS.53
4.2 SIGNALFUNKTIONEN DER ZYTOPLASMATISCHER DOMAENEN DES LFA-1
-INTEGRINS.57
4.2.1 KONSTRUKTION UND EXPRESSION CHIMAERER SLG-FUSIONSPROTEINE.58
4.2.2 ANALYSE DES CALCIUMSIGNALS NACH QUERVEMETZUNG DER LFA-1
-FUSIONSPROTEINE.62
4.2.3 AKTIVIERUNG DES IL-2-PROMOTORS NACH QUERVEMETZUNG DER
CD18-UNTEREINHEIT.64
4.3 IDENTIFIZIERUNG MOLEKULARER KOMPONENTEN DER CD 18-SIGNALKASKADE.66
4.3.1 BEITRAG VON NICHT-REZEPTOR-TYROSINKINASEN ZUR CD
18-SIGNALTRANSDUKTION YY.67
4.3.2 ABHAENGIGKEIT DER CD18-SIGNALTRANSDUKTION VOM TCR.69
4.3.3 REKONSTITUTION DER CD 18-SIGNALTRANSDUKTION IN TCR-DEFIZIENTEN
JURKAT ZELLEN.71
4.3.4 UMVERTEILUNG VON MEMBRANREZEPTOREN NACH T-ZELL-AKTIVIERUNG.76
4.3.5 ERMITTLUNG DER SIGNALKAPAZITAET DES MIT CD 18-ASSOZIIERTEN DNAM-1
-REZEPTORS.80
4.4 MUTATIONSANALYSE DES ZYTOPLASMATISCHEN ANTEILS DER CD 18-KETTE.82
4.4.1 ANALYSE CARBOXYTERMINALER DELETIONSMUTANTEN DER
CD18-UNTEREINHEIT.83
4.4.2 EINFLUSS DES MEMBRANDISTALEN NPXF-MOTIVS AUF DIE
CD18-SIGNALFUNKTION.86
4.5 MUTATION DES MEMBRANDISTALEN NPXY-MOTIVS DER CD29-KETTE.88
4.6 ANALYSE DER CD18-PUNKTMUTANTEN IM KONTEXT DES LFA-L-MOLEKUELS.91
4.6.1 REKONSTITUTION DER ADHAESIVITAETFCDL8-DEFIZIENTER SK-SS2.7 ZELLEN.92
4.6.2 BEITRAG DES ZYTOPLASMATISCHEN CD18-ANTEILS ZUR ZYTOLYSE.96
5 DISKUSSION.101
5.1 LFA-1 ALS COSTIMULATORISCHES MOLEKUEL DER T-ZELL-AKTIVIERUNG.102
5.1.1 LFA-1 INDUZIERT NACH ICAM-BINDUNG DEN IL-2-PROMOTOR IN
T-HELFER-ZELLEN.102
5.1.2 T-ZELLEN BENOETIGEN LFA-1 FUER IHRE ZYTOTOXISCHE AKTIVITAET.103
5.2 SIGNALTRANSDUKTIONSKAPAZITAET DER INDIVIDUELLEN
LFA-1-UNTEREINHEITEN.104
5.2.1 QUERVEMETZUNG DER CD 18-UNTEREINHEIT INDUZIERT ZELLULAEREN
CALCIUM-EINSTROM.105
5.2.2 STIMULATION DER CD18-KETTE AKTIVIERT DEN IL-2-PROMOTOR.106
5.3 MECHANISMUS DER CD 18-VERMITTELTEN SIGNALTRANSDUKTION.109
5.3.1 GEGENUEBERSTELLUNG DER SIGNALTRANSDUKTIONSMECHANISMEN VON CD 18 UND
CD28.111
5.3.2 VERKNUEPFUNG DER SIGNALKASKADEN DER CD 18-UNTEREINHEIT UND DES
TCRS.113
5.3.3 FUNKTIONELLE ASSOZIATION DER SIGNALKASKADEN VON CD 18 UND
DNAM-1.116
5.3.4 UNTERSCHIEDE IN DER CD18- UND CD29-SIGNALKAPAZITAET.118
5.4 CD18-SIGNALFUNKTION IST ABHAENGIG VOM MEMBRANDISTALEN NPXF-MOTIV.119
5.4.1 DAS MEMBRANDISTALE NPXF-MOTIV IST ESSENTIELL FUER DAS CD
18-CALCIUMSIGNAL.121
5.4.2 EINFUEHRUNG EINES NPXF-MOTIVS IN CD29 INDUZIERT ZELLULAEREN
CALCIUM-EINSTROM.122
5.4.3 BEDEUTUNG DES NPXF-MOTIVS FUER DIE FUNKTION DES GESAMTEN
LFA-1-MOLEKUELS.124
5.5 AUSBLICK.127
6 ANHANG.129
6.1 LITERATURVERZEICHNIS.129
6.2 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.144
6.3
TABELLARISCHER LEBENSLAUF.149 |
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