Erzeugung und Analyse NF-ATp-defizienter Mäuse:
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Format: | Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2001
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Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS:
0.1. ZUSAMMENFASSUNG.6
0.2. SUMMARY.8
1. EINLEITUNG.10
1.1. DIE FUNKTION DER T-LYMPHOZYTEN IM IMMUNSYSTEM.10
1.1.1. DIE REIFUNG DER T-ZELLEN. 11
1.1.2. DIE AKTIVIERUNG UND DIFFERENZIERUNG PERIPHERER T-LYMPHOZYTEN.13
1.1.3. KO-STIMULATORISCHE SIGNALE BEI DERT-ZELLAKTIVIERUNG.13
1.2. ZYTOKINE UND IHRE FUNKTION.14
1.2.1. AUSGEWAEHLTE LYMPHOKINE UND IHRE REZEPTOREN.14
1.2.2. DIE BEDEUTUNG DER ZYTOKINE FUER DIE T-ZELLDIFFERENZIERUNG.19
1.3. DIE SIGNALUEBERTRAGUNGSWEGE WAEHREND DER T-ZELLATDIVIERUNG.21
1.3.1. TYROSIN-PROTEINKINASEN UND TYROSIN-PROTEINPHOPHATASEN.21
1.3.2. DIE INTRAZELLULAERE SIGNALWEITERLEITUNG. 22
1.3.2.1. DIE PHOSPHOLIPASE C.23
1.3.2.2. DIE PHOSPHATIDYLINOSITOL-3-KINASE (PI3-KINASE).23
1.3.2.3. DIE PROTEINKINASE C-FAMILIE.24
1.3.2.4. DIE MAPK-SIGNALKASKADE.25
1.3.2.5. DER [CA
2+]J-SIGNALWEG UND CALCINEURIN.27
1.3.3. DIE SIGNALUEBERTRAGUNG DES CD28-KOSTIMULUS.28
1.3.4. DIE SIGNALUEBERTRAGUNG DURCH DEN LNTERLEUKIN-2 REZEPTOR.29
1.3.4.1. AKTIVIERUNG VON SHC UND AKTIVIERUNG DES RAS-SIGNALWEGS.29
1.3.4.2. DER PI3-KINASE-SIGNALWEG.30
1.3.4.3. DER JAK-STAT-SIGNALWEG NACH IL-2R-AKIVIERUNG.30
1.4. DIE FAMILIE DER NF-AT-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN.31
1.4.1. REGULATION DER NF-AT-AKTIVIERUNG.31
1.4.2. DIE MITGLIEDER DER NF-AT-FAMILIE.33
1.4.3. SEQUENZHOMOLOGIEN UND FUNKTIONELLE DOMAENEN DER NF-AT-FAKTOREN.33
1.4.4. GEWEBSSPEZIFISCHE EXPRESSION DER NF-AT-FAKTOREN.35
1.4.5. INTERAKTION MIT ANDEREN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN.36
1.5. ERZEUGUNG GEN-DEFIZIENTER MAEUSE.36
2. MATERIALIEN UND METHODEN.38
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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_INHALTSVERZEICHNIS
2.1. MATERIALIEN.38
2.1.1. BAKTERIEN UND BAKTERIOPHAGEN.38
2.1.2 GEWEBEKULTURZELLEN.38
2.1.3. NAEHRMEDIEN.39
2.1.4. GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN.41
2.1.5. CHEMIKALIEN UND REAKTIONSSYSTEME.42
2.1.6. LOESUNGEN UND PUFFER. 44
2.1.7. ENZYME.52
2.1.8. DNA-FRAGMENTLAENGENSTANDARDS.52
2.1.9. EINGESETZTE OLIGONUKLEOTIDE:.53
2.1.10. VERWENDETE PLASMIDE:.54
2.1.11. ANTIKOERPER.54
2.2. METHODEN. 55
2.2.1. EXTRAKTION VON PLASMID-DNA AUS 3 ML-BAKTERIENLUTUREN.55
2.2.2. EXTRAKTION VON PLASMID-DNA AUS 500 ML-BAKTERIENKULTUEREN.55
2.2.3. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.56
2.2.4. DNA-GELELEKTROPHORESE.56
2.2.4.1. AGAROSEGELE.56
2.2.4.2. POLYACRYLAMIDGELE.57
2.2.5. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.57
2.2.5.1. ISOLIERUNG AUS EINEM AGAROSEGEL.57
2.2.5.2. ISOLIERUNG AUS EINEM POLYACRYLAMIDGEL.58
2.2.6. DNA-KLONIERUNGSTECHNIKEN.58
2.2.6.1. RESTRIKTIONSSPALTUNG.58
2.2.6.2. AUFFUELLEN VON 5'- UEBERHAENGEN MIT "KLENOW-FRAGMENT".58
2.2.6.3. PHOSPHATASEBEHANDLUNG. 59
2.2.6.4. LIGATION.59
2.2.7. EINFUEHREN VON PUNKTMUTATIONEN IN PLASMIDE.59
2.2.8. DNA-SEQUENZIERUNG.60
2.2.8.1. DIE SEQUENZIERREAKTION.60
22
.
8
.
2
.
AUFREINIGUNG DER SEQUENZIERUNGSREAKTION MITTELS GELFILTRATION.60
2.2.8.3. ANALYSE DER SEQUENZIERUNGSPRODUKTE.61
2.2.9. KULTIVIERUNG VON E. COLI-BAKTERIEN.61
2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.9.1. UEBEMACHTKULTUREN IN KLEINEM MASSSTAB.61
2.2.9.2. UEBERNACHTKULTUREN IN GROSSEM MASSSTAB.61
2.2.9.3. ERHALTUNGSKULTUREN.62
2.2.9.4. HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN.62
2.2.9.5. TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN.62
2.2.10. KULTUR VON ^-PHAGEN.63
2.2.11. KULTUR UND VERARBEITUNG VON SUSPENSIONZELLEN.63
2.2.11.1. KULTUR VON EL4-, JURKAT-T-ZELLEN UND PERIPHEREN BLUTZELLEN DER
MAUS.63
2.2.11.2. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL.63
2.2.11.3. UMSETZEN VON EL4- UND JURKAT-T-ZELLEN BZW. MEDIUMWECHSEL BEI
PERIPHEREN LYMPHOZYTEN DER MAUS.63
2.2.11.4. TRANSFEKTION VON DNA IN EL4- UND JURKAT-T-ZELLEN.64
2.2.11.5. INDUKTION VON EL4- UND JURKAT-T-ZELLEN. 64
2.2.12. PRAEPARATION VON PROTEINEXTRAKTEN.65
2.2.12.1. PRAEPARATION VON GESAMTPROTEINEXTRAKTEN AUS
SUSPENSIONSZELLEN.65
2.2.12.2. "MINIPRAEPARATION" VON KERNPROTEINEXTRAKTEN (SCHREIBER ET
AL.,1989; GERBER
ET AL., 1992, MODIFIZIERT) AUS SUSPENSIONSZELLEN.65
2.2.12.3. HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS EI4- UND JURKAT-ZELLEN
FUER
"LUCIFERASE-ASSAYS"
UND DURCHFUEHRUNG DES ASSAYS.66
2.2.12.4. PRAEPARATION REKOMBINATER GST-FUSIONSPROTEINE AUS E. COLI.66
2.2.12.5. BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTS VON ZELLEXTRAKTEN (BRADFORD,
1976).67
2.2.13. DNA-PROTEIN-BINDUNGSSTUDIEN.67
2.2.13.1.
"ANNEAUNCF' VON EINZELSTRAENGIGEN OLIGONUKLEOTIDEN.67
2.2.13.2. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN.67
2.2.13.3. "ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY" (EMSA).68
2.2.13.4. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAG^) UND "WESTERN
BLOT".68
2.2.14. KULTUR UND GENETISCHE MANIPULATION EMBRYONALER STAMMZELLEN
(ES-ZELLEN)
DER MAUS.70
2.2.14.1. GENERELLE BEDINGUNGEN ZUR HALTUNG EMBRYONALER STAMMZELLEN.70
2.2.14.2. PRAEPARATION EMBRYONALER MAUSFIBROBLASTEN.72
2.2.14.3. PRAEPARATION VON INAKTIVIERTEN "FEEDER-ZELLEN AUS MEFS UND
SLN-ZELLEN73
2.2.14.4. KULTIVIERUNG VON ES-ZELLEN AUF "FEEDER-ZELLEN.74
2.2.14.5. EINFRIEREN, LAGERUNG UND AUFTAUEN VON "FEEDER
1'- UND ES-ZELLEN.74
3
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.14.6. ELEKTROPORATION VON ES-ZELLEN.74
2.2.14.7. SELEKTION VON ELEKTROPORIERTEN ES-ZELLEN.75
2.2.14.8. EXPANSION UND KONSERVIERUNG G418-RESISTENTER ES-ZELL-KLONE.75
2.2.14.9. PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS ES-ZELLEN.76
2.2.14.10.
"SCREENING' VON ES-ZELL-KOLONIEN AUF HOMOLOGE REKOMBINATION MITTELS
"
SOUTHERN BLOTTING'.76
2.2.15. BLASTOZYSTENINJEKTION UND EMBRYOTRANSFER.
Y.77
2.2.15.1. EXPANSION VON ES-ZELLEN ZUR SPAETEREN BLASTOZYSTENINJEKTION.77
2.2.15.2. GEWINNUNG VON BLASTOZYSTEN.78
2.2.15.3. BEREITSTELLUNG SCHEINSCHWANGERER AMMENMUETTER.78
2.2.15.4. ISOLATION UND LAGERUNG VON BLASTOZYSTEN.79
2.2.15.5. HERSTELLUNG VON GLASPIPETTEN ZUR MIKROINJEKTION VON
BLASTOZYSTEN.80
2.2.15.6. INJEKTION VON BLASTOZYSTEN.~.80
2.2.15.7. EMBRYOTRANSFER IN AMMENMUETTER.81
2.2.15.8. FESTSTELLUNG DER KEIMBAHNTRANSMISSION ANHAND DER FELLFARBE.81
2.2.16. BESTIMMUNG DES GENOTYPS.82
2.2.16.1. ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS EINER SCHWANZBIOPSIE.82
2.2.16.2. PCR- UND SOUTHERN-BLOTTING ZUR BESTIMMUNG DES GENOTYPS AUS
SCHWANZ
DNA.83
3. ERGEBNISSE.84
3.1. ERZEUGUNG NF-ATP-DEFIZIENTER MAUSLINIEN.84
3.1.1. KLONIERUNG DES "TARGETING VECTORS".84
3.1.2. HERSTELLUNG HETEROZYGOT NF-ATP-DEFIZIENTER ES-ZELLEN.
84
3.1.3 HERSTELLUNG HOMOZYGOT NF-ATP-DEFIZIENTER (NF-ATP'
7'-) MAEUSE.86
3.1.4. NACHWEIS DER GENDEFIZIENZ.87
3.1.5. UNTERSUCHUNGEN ZUR ENTWICKLUNG DER NF-ATP^'-TYAEUSE.89
3.2. NF-ATP-DEFIZIENTE MAEUSE ZEIGTEN EINE ERHOEHTE ZAHL PRAEAKTIVIERTER
LYMPHOZYTEN IN PERIPHEREN LYMPHATISCHEN ORGANEN.89
3.3. VERSTAERKTE SEKUNDAERE IMMUNANTWORT UND VERMINDERTE KLONALE DELETION
NF-ATP-DEFIZIENTER T-ZELLEN.91
3.3.1. NF-ATP
V-T-ZELLEN ZEIGTEN EINE VERSTAERKTE SEKUNDAERE IMMUNANTWORT.91
3.3.2. VERMINDERTE KLONALE DELETION DER NF-ATP
V'-T-ZELLEN NACH VORHERIGER
STIMULATION.92
4
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3. DIE VERMINDERTE KLONALE DELETION IN NF-ATP^'-MAEUSEN IST
UNABHAENGIG VOM
FAS-/FAS-LIGANDEN-SYSTEM.93
3.4. REDUZIERTE INVOLUTION DES THYMUS UND MASSIVE BILDUNG VON
KEIMZENTREN
IN DEN MILZEN NF-ATP-DEFIZIENTER MAEUSE.94
3.4.1. REDUZIERTE INVOLUTION DES THYMUS.94
3.4.2. VERSTAERKTE BILDUNG VON KEIMZENTREN IN MILZEN NF-ATP-DEFIZIENTER
MAEUSE
. 96
3.5. NF-ATP-DEFIZIENZ FUEHRT ZU EINER VERZOEGERTEN UND INSGESAMT
VERMINDERTEN
EXPRESSION VON CD25.97
3.5.1. NF-ATP-DEFIZIENTE ZELLEN ZEIGEN NACH AKTVIERUNG EINE VERZOEGERTE
EXPRESSION VON CD25.97
3.5.2. DER CD25-PROMOTOR IST IN EL-4-ZELLEN DURCH NF-ATP STAERKER
TRANSAKTIVIERBAR ALS DURCH NF-ATC. 99
3.5.3. DER CD25-PROMOTOR ENTHAELT MINDESTENS ZWEI
NF-AT-BINDUNGSSTELLEN.100
3.5.4. MUTATIONEN IN DEN NF-AT-BINDUNGSSTELLEN FUEHREN ZUM VERLUST DER
CD25-
PROMOTORAKTIVITAET.103
4. DISKUSSION.105
4.1. KOMPLETTER VERLUST DES NF-ATP-PROTEINS.105
4.2. ERHOEHTE ZELLZAHL IN LYMPHATISCHEN ORGANEN NF-ATP-DEFIZIENTER MAEUSE
UND PRAEAKTIVIERTER ZUSTAND DER NF-ATP
V"-LYMPHOZYTEN.106
4.3. VERSTAERKTE SEKUNDAERE IMMUNANTWORT UND VERMINDERTE KLONALE DELETION.
107
4.4. DIE VERMINDERTE KLONALE DELETION VON T-ZELLEN IN
NF-ATP^'-MAEUSEN.107
4.5. REDUZIERTE INVOLUTION DES THYMUS UND MASSIVE ZUNAHME DER
KEIMZENTREN-BILDUNG IN NF-ATP-DEFIZIENTEN MAEUSEN.108
4.6. TRANSAKTIVIERUNG DES CD25-PROMOTERS DURCH NF-ATP.110
4.7. BINDUNG VON NF-AT-FAKTOREN AN ZWEI SEQUENZEN DES CD25-PROMOTORS
.111
4.8. REDUZIERTE EXPRESSION VON CD25 AUF T-ZELLEN AUS NF-ATP^'-MAEUSEN
.112
5. REFERENZEN.113
_LEBENSLAUF:.148
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