Polysialylierung des neutralen Zelladhäsionsmoleküls NCAM durch die Sialyltransferasen ST8Sia II und ST8Sia IV in Tumorzellen und im Verlauf der neuronalen Differenzierung:
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2000
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INHALT
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
SIALLNSAEURE
AUF
DER
ZELLOBERFLAECHE
.
1
1.2
MODIFIKATION
DES
NEURALEN
ZELLADHAESIONSMOLEKUELS
(NCAM)
DURCH
POLY
SIAIINSAEURE
(PSA)
.3
1.2.1
MODULATION
VON
ZELL-ZELL-INTERAKTIONEN
DURCH
PSA-NCAM
.
6
1.2.2
PSA-NCAM
UND
ZELLULAERE
PLASTIZITAET
IM
NERVENSYSTEM
.
7
1.2.3
PSA-NCAM
ALS
PROMOTOR
DER
TUMORPROGRESSION
.8
1.2.4
BIOSYNTHESE
VON
PSA
DURCH
POLYSIALYLTRANSFERASEN
.
11
1.2.5
NEUROBLASTOM-ZELLINIEN
ALS
MODELLE
ZUR
NCAM-POLYSIALYLIERUNG
IN
TUMORZELLEN
UND
BEI
NEURONALER
DIFFERENZIERUNG
.
12
1.3
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
14
2
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
15
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
17
3.1
MATERIAL
.
17
3.1.1
CHEMIKALIEN
.
17
3.1.2
VERSUCHSTIERE
.
18
3.1.3
ZELLINIEN
.
18
3.1.4
BAKTERIENSTAEMME
.
19
3.1.5
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
.
19
3.1.6
OLIGONUKLEOTIDE
.
20
3.1.7
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
.
21
3.1.8
ANTIKOERPER
.
22
3.1.9
ENZYME
.
22
3.1.10
WACHSTUMSFAKTOREN
.
23
3.1.11
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
23
3.1.12
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
25
ZELLKULTUR
.
25
BAKTERIENKULTUR
.
26
PLASMID-AUFREINIGUNG
.
26
RNA-ISOLATION
.
26
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
27
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
28
DNA-SEQUENZIERUNG
.
28
GELELEKTROPHORESEN
.
28
PROTEINEXTRAKTION
.
29
PROTEINBESTIMMUNG
.
29
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
29
IMMUNCYTOCHEMIE
.
31
3.3
METHODEN
.
32
3.3.1
EUKARYOTISCHE
ZELLKULTURTECHNIK
.
32
3.3.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
.
32
KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
32
KULTUR
UND
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
ZELLEN
.
33
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
.
33
VERMEHRUNG
UND
ISOLATION
VON
PLASMID-DNA
.
34
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
34
ISOLATION
VON
RNA
AUS
ZELLINIEN
UND
GEWEBEN
.
34
REVERSE
TRANSKRIPTION
.35
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.36
DENSITOMETRISCHE
QUANTIFIZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
37
DNA-SEQUENZIERUNG
.
38
3.3.3
PROTEINBIOCHEMISCHE
UND
ELISA
TECHNIKEN
.
38
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
.
38
ISOLATION
VON
PSA-NCAM
.39
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
VON
ZELLYSATEN
NACH
LAEMMLI
ET
AL.
(1970)
.
39
PROTEINTRANSFER
DURCH
ELEKTROBLOTTING
NACH
TOWBIN
ET
AL.
(1979)
.
40
INHALT
COOMASSIE
UND
POINCEAU
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
.
40
IMMUNDETEKTION
IM
WESTERN
BLOTS
DURCH
VERSTAERKTE
CHEMOLUMINESZENZ
(ECL)
.
40
QUANTIFIZIERUNG
VON
PSA
IM
ELISA
.40
BESTIMMUNG
VON
RE-EXPRESSIONSRATEN
IM
ZELLULAEREN
ELISA
.
41
3.3.4
IMMUNCYTOCHEMIE,
MIKROSKOPIE
UND
DIGITALE
BILDBEARBEITUNG
.
42
3.3.5
STATISTIK
.
43
4
ERGEBNISSE
.
44
4.1
REGULATION
DER
POLYSIALYLLERUNG
VON
NCAM
IN
TUMORZELLLNLEN
.
44
4.1.1
EXPRESSION
VON
PSA-NCAM
AN
DER
ZELLOBERFLAECHE
VON
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
.
44
4.1.2
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNAS
IN
PSA-POSITIVEN
TUMORZELLINIEN
.
45
4.1.3
KORRELATION
DER
NCAM-POLYSIALYLIERUNG
MIT
DER
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNA
EXPRESSION
.
51
4.1.4
ZELLULAERE
PSA-SYNTHESEKAPAZITAET
UND
POLYSIALYLTRANSFERASE-AUSSTATTUNG
.53
4.1.5
EINFLUSS
DER
POLYSIALYLTRANSFERASE-AUSSTATTUNG
AUF
DIE
SLALYLLERUNG
VON
NCAM
.55
4.2
REGULATION
DER
POLYSIALYLLERUNG
VON
NCAM
IM
VERLAUF
DER
NEURONALEN
DIFFERENZIERUNG
VON
NEUROBLASTOMZELLEN
.
58
4.2.1
RETINSAEURE-INDUZIERTE
DIFFERENZIERUNG
DER
NEUROBLASTOM-ZELLINIEN
SH-SY5Y
UND
LAN-5
.
58
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNA-EXPRESSION
IN
RETINSAEURE-INDUZIERTER
DIFFERENZIERUNG
VON
SH-SY5Y
UND
LAN-5-ZELLEN
.60
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNA-EXPRESSION
IN
NEURONALEN
DIFFERENZIERUNGSMODELLEN
VON
SH-SY5Y
M
^-ZELLEN
.
61
MENGENVERHAELTNIS
VON
ST8SLA
II
UND
ST8SIA
IV-MRNAS
IN
SH-SY5Y-ZELLEN
.
63
4.2.2
KAPAZITAET
ZUR
POLYSIALYLLERUNG
VON
NCAM
NACH
RETLNSAEURE-INDUZIERTER
DIFFERENZIERUNG
IN
SH-SY5Y
UND
LAN-5-ZELLEN
.64
RE-EXPRESSION
VON
PSA
.64
PSA-MENGEN
UND
NCAM-EXPRESSION
.67
SIALYLIERUNGSGRAD
VON
NCAM
.69
4.2.3
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
VON
NCAM
UND
PSA
.70
4.2.4
EXPRESSION
DER
NCAM-SPLEISSVARIANTE
VASE
IN
NEUROBLASTOM-ZELLINIEN
.72
4.3
EXPRESSION
VON
PSA
UND
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNAS
IN
DER
POSTNATALEN
ENTWICKLUNG
DER
RATTE
.
73
5
DISKUSSION
.
77
5.1
QUANTITATIVER
NACHWEIS
VON
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNAS
.77
5.2
PARAMETER
DER
NCAM-POLYSLALYLLERUNG
.79
5.2.1
PSA-ISOLATION
AUS
ZELLYSATEN
.79
5.2.2
SIALYLIERUNGSGRAD
VON
NCAM
.79
5.2.3
RE-EXPRESSION
VON
PSA NACH
ENZYMATISCHEM
VERDAU
VON
DER
ZELLOBERFLAECHE
.
80
5.3
REGULATION
DER
PSA-SYNTHESE
DURCH
DIE
POLYSLALYLTRANSFERASEN
STSSIA
II
UND
ST8SLA
IV
.
82
5.3.1
TRANSKRIPTIONALE
REGULATION
VON
ST8SIA
II
UND
STSSIA
IV
.83
5.3.2
MOEGLICHE
REGULATIONSMECHANISMEN
DER
NCAM-POLYSIALYLIERUNG
.
84
5.3.3
RETINSAEURE-INDUZIERTE
POLYSIALYLTRANSFERASEN-MRNA-EXPRESSLON
IN
NEURONALER
DIFFERENZIERUNG
.87
5.3.4
LIMITIERENDE
FAKTOREN
DER
NCAM-POLYSIALYLIERUNG
NACH
RETLNSAEURE-INDUZIERTER
DIFFERENZIERUNG
VON
SH-SY5Y-ZELLEN
.
89
5.3.5
KOOPERATIVE
PSA-SYNTHESE
DURCH
ST8SLA
II
UND
ST8SIA
IV
.92
5.4
SCHLUSSFOLGERUNGEN
UND
AUSBLICK
.93
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
95
7
LITERATUR
.
97
ANHANG:
DANKSAGUNG,
LEBENSLAUF
.
112 |
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