Oberflächen-plasmon-resonanz-spektroskopische Studie an verschiedenen Biosensoroberflächen: Charakterisierung von Protein-Peptid- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen
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Jülich
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2000
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INHALT
ZUSAMMENFASSUNG
I
INHALT
II
ABKUERZUNGSVERZEICHNUNG
VI
AMINOSAEUREN
IX
1
EINLEITUNG
1
1.1
OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ
SPEKTROSKOPIE
1
1.2
THEORIE
DER
OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ
SPEKTROSKOPIE
2
1.3
GLEICHGEWICHT
UND
KINETIK
4
1.4
SENSOROBERFLAECHEN
IN
DER
OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ
SPEKTROSKOPIE
5
1.5
LIMITATIONEN
IN
DER
BESTIMMUNG
KINETISCHER
RATENKONSTANTEN
6
1.5.1
TRANSPORTVORGAENGE
AN
DIE
DEXTRANOBERFLAECHE
6
1.5.2
MASSENTRANSPORT
INNERHALB
DER
DEXTRANMATRIX
8
1.5.3
MOEGLICHKEITEN
ZUR
VERRINGERUNG
DES
MASSENTRANSPORTEFFEKTS
9
1.6
CALCIUMSENSOREN
MIT
EF-HAND-STRUKTUR
10
1.6.1
CALMODULIN
10
1.6.2
REGULATION
DER
NO-SYNTHASEN
DURCH
CALMODULIN
(CAM)
12
1.6.3
RECOVERIN
14
1.7
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
15
2
MATERIAL
UND
METHODEN
16
2.1
CHEMIKALIEN
UND
MATERIALIEN
16
2.2
GERAETE
UND
MATERIALIEN
16
2.3
REINIGUNG
VON
RECOVERIN
AUS
GANZEN
NETZHAEUTEN
17
2.4
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
RECOVERIN
17
2.4.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
17
2.4.2
RETRANSFORMATION
17
2.4.3
ANZUCHT
VON
.CO/I-ZELLEN
18
2.4.4
MINI-PRAEPARATION
18
2.4.5
BINDUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
AN
GLUTATHION-AGAROSE
18
2.4.6
THROMBINVERDAU
DES
FUSIONSPROTEINS
19
2.4.7
MONO
Q
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
19
2.5
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
19
2.6
HERSTELLUNG
VON
GEWASCHENEN
ROS-MEMBRANEN
19
2.6.1
HERSTELLUNG
VON
LIPID-VESIKELN
AUS
GEWASCHENEN
ROS-MEMBRANEN
20
2.6.2
HERSTELLUNG
GROSSER
UNILAMMELARER
VESIKEL
DURCH
EXTRUSION
(LUVET)
20
2.7
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
20
2.7.1
COOMASSIE-BLAU
FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
21
INHALT
III
2.8
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
(WESTERN
BLOTTING)
UND
DETEKTION
21
2.8.1
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
21
2.8.2
AUSWERTUNG
DER
CHEMILUMINESZENZ
21
2.8.3
AMIDO-SCHWARZ
FAERBUNG
VON
TRANSFERMEMBRANEN
22
2.9
PEPTID
22
2.10 OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ
SPEKTROSKOPIE
22
2.10.1
IMMOBILISIERUNG
DER
LIGANDEN
22
2.10.2
MESSUNG
DER
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
LIGAND
UND
ANALYT
24
2.10.3
AUSWERTUNG
DER
SENSORGRAMME
24
2.11
REGENERATION
DER
BIACORE
SENSORCHIPS
29
2.11.1
EXPERIMENTELLER
AUFBAU
ZUR
ENTFERNUNG
DER
SENSORCHIP
BESCHICHTUNG
29
2.11.2
CHEMISCHE
OXIDATION
DER
SENSOROBERFLAECHE
31
2.11.3
BIOCHEMISCHE
OXIDATION
DER
DEXTRANOBERFLAECHE
32
2.11.4
OXIDATION
DER
GOLD-SCHWEFELVERBINDUNGEN
32
2.11.5
BESCHICHTUNG
MIT
VERSCHIEDENEN
ALKANTHIOLEN
32
3
ERGEBNISSE 34
3.1
OXIDATION
GEBRAUCHTER
BIACORE
SENSORCHIPS
34
3.1.1
CHEMISCHE
OXIDATION
MIT
KOH/H2O2
3
5
3.1.2
BIOCHEMISCHE
OXIDATION
MIT
EINER
KOMBINATION
AUS
DEXTRANASE
UND
36
UV-LICHT
3.2
BESCHICHTUNG
MIT
ALKANTHIOLEN
37
3.2.1
BELEGUNG
DER
GOLDOBERFLAECHE
MIT
OCTADECYLMERCAPTAN
(0DM)
37
3.2.2
BELEGUNG
DER
OBERFLAECHE
MIT
EINER
ALKANTHIOL-MISCHUNG
AUS
MERCAPTO-
38
UNDEKANSAEURE
(MUA)
UND
MERCAPTOUNDEKANAL
(MUOL)
IM
VERHAELTNIS
1:1
3.3
HERSTELLUNG
VON
HETERODOPPELSCHICHTEN
UND
PHOSPHOLIPID-DOPPELSCHICHTEN
40
3.3.1
BILDUNG
EINER
HETERODOPPELSCHICHT
AUS
0DM
UND
PHOSPHOLIPIDEN
DURCH
40
HYDROPHOBE
WECHSELWIRKUNG
3.3.2
STABILITAET
DER
HETERODOPPELSCHICHTEN
42
3.4
CHEMISCHE
KOPPLUNG
VON
PHOSPHOLIPIDEN
AUF
MUA
43
3.5
WECHSELWIRKUNG
VON
NO-SYNTHASE
MIT
CAM
46
3.5.1
WECHSELWIRKUNG
VON
NOS-IWT
MIT
CAM
AN
VERSCHIEDENEN
47
SENSOROBERFLAECHEN
3.6
ANALYSE
DER
ASSOZIATIONS
UND
DISSOZIATIONSPHASE
BEI
VERSCHIEDENEN
53
IMMOBILISIERUNGSDICHTEN
3.6.1
ABHAENGIGKEIT
DER
RESONANZSIGNALE
VON
DER
IMMOBILISIERUNGSDICHTE
53
INHALT
IV
3.6.2
BESTIMMUNG
DER
RATENKONSTANTEN
UND
GLEICHGEWICHTSKONSTANTEN
BEI
HOHER
55
UND
NIEDRIGER
IMMOBILISIERUNGSDICHTE
AN
VERSCHIEDENEN
OBERFLAECHEN
3.6.3
ANALYSE
DER
ERHALTENEN
KINETISCHEN
DATEN
AUF
MONOEXPONENTIELLE
BINDUNG
64
NACH
LANGMUIR
3.6.4
ANWENDUNG
DER
KRITERIEN
FUER
MONOEXPONENTIELLE
BINDUNG
64
3.6.4.1
CM5-DEXTRANOBERFLAECHE
64
3.OE.4.2
FL
-
VERKUERZTE
DEXTRANSCHICHT
66
3.6.4.3
CI
-
MONOSCHICHT
AUS
CARBOXYMETHYLIERTEN
ALKANTHIOLEN
66
3.6.4.4
SAM
-
MONOSCHICHT
AUS
EINER
1:1
MISCHUNG
VON
CARBOXYMETHYLIERTEN UND
67
HYDROXYLIERTEN
ALKANTHIOLEN
3.6.5
ANALYSE
DER
RATENKONSTANTEN
FUER
DIE
ASSOZIATION
K
A
UND
DIE
68
DISSOZIATION
KA
3.6.6
ANTEIL
MONOEXPONENTIELLER
BINDUNG
AM
RESONANZSIGNAL
IN
ABHAENGIGKEIT
71
VON
DER
IMMOBILISIERUNGSDICHTE
UND
DER
VERWENDETEN
SENSOROBERFLAECHE
3.7
OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
WECHSELWIRKUNG
VON
72
RECOVERIN
UND
RECOVERIN-MUTANTEN
MIT
HETERODOPPELSCHICHTEN
AUS
ODM
UND
PHOSPHOLIPIDEN
3.7.1
WT
RECOVERIN
UND
VERSCHIEDENE
EF-HAND
MUTANTEN
VON
RECOVERIN
72
3.7.2
AUSBILDUNG
VON
HETERODOPPELSCHICHTEN
AUF
HYDROPHOBEN
73
SENSOROBERFLAECHEN
3.7.3
CA
2+
-MYRISTOYL-SWITCH
VON
NATIVEM
RECOVERIN
AN
EINER
HETERO
73
DOPPELSCHICHT
3.7.4
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
BINDUNG
VON
NATIVEM
RECOVERIN
AN
EINE
74
HETERODOPPELSCHICHT
3.7.5
CA
2+
-MYRISTOYL-SWITCH
VON
REKOMBINANTEM
MYRISTOYLIERTEM
RECOVERIN
AN
76
EINER
HETERODOPPELSCHICHT
3.7.6
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
BINDUNG
VON
REKOMBINANTEM
MYRISTOYLIERTEM
77
RECOVERIN
AN
EINE
HETERODOPPELSCHICHT
3.7.7
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
BINDUNG
VON
RECOVERIN-MUTANTEN
AN
EINE
79
HETERODOPPELSCHICHT
3.8
QUANTITATIVE
WESTERN
BLOT
ANALYSE
ZUR
WECHSELWIRKUNG
VON
RECOVERIN
81
UND
RECOVERIN-MUTANTEN
MIT
MEMBRANEN
3.8.1
WECHSELWIRKUNG
VON
RECOVERIN
UND
RECOVERIN-MUTANTEN
MIT
82
PHOSPHOLIPIDEN
3.8.2
WECHSELWIRKUNG
VON
RECOVERIN
UND
RECOVERIN-MUTANTEN
MIT
ROS-
83
MEMBRANEN
3.8.3
VERGLEICH
DER
ERGEBNISSE
AUS
QUANTITATIVER
WESTERN
BLOT
ANALYSE
MIT
84
ERGEBNISSEN
AUS
OBERFLAECHEN-PLASMON-RESONANZ
SPEKTROSKOPIE
INHALT
V
4.
DISKUSSION
87
4.1
OXIDATION
GEBRAUCHTER
DEXTRANSENSOROBERFLAECHEN
87
4.2
BESCHICHTUNG
VON
GOLDOBERFLAECHEN
MIT
ALKANTHIOLEN
88
4.3
AUSBILDUNG
VON
HETERODOPPELSCHICHTEN
88
4.4
WECHSELWIRKUNG
VON
PEPTID
NOS-I
MIT
CAM
AN
VERSCHIEDENEN
88
SENSOROBERFAECHEN
4.4.1
VERGLEICH
DER
SENSORGRAMME
DER
VERSCHIEDENEN
SENSOROBERFLAECHEN
MIT
93
ERGEBNISSEN
DER
SPR-SPEKTROSKOPISCHEN
UNTERSUCHUNGEN
VON
ZOCHE
(1997)
4.5
AFFINITAET
VON
RECOVERIN
UND
RECOVERIN-MUTANTEN
AN
HETERO
95
DOPPELSCHICHTEN
4.5.1
BINDUNG
VON
NATIVEM
RECOVERIN
AN
EINE
HETERODOPPELSCHICHT
95
4.5.2
WECHSELWIRKUNG
VON
RECOVERIN
UND
RECOVERIN-MUTANTEN
MIT
EINER
96
HETERODOPPELSCHICHT
4.6
AUSBLICK
97
5
ANHANG
98
5.1
BERECHNUNG
DES
MAXIMALEN
RESONANZSIGNALS
FUER
EINE
IMMOBILISIERUNGS
98
DICHTE
AN
PEPTID
NOS-I
BEI
SAETTIGENDER
CAM-KONZENTRATION
5.2
ABSCHAETZUNG
DES
MITTLEREN
ABSTANDS
VON
PEPTID
NOS-I
AUF
DEN
98
SENSORCHIPOBERFLAECHEN
5.3
ZUSAMMENFASSUNG
DER
KINETISCHEN
DATEN
99
5.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
KINETISCHEN
DATEN
FUER
RECOVERIN
114
6
LITERATURVERZEICHNIS
118 |
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| spelling | Fischer, Torsten Verfasser aut Oberflächen-plasmon-resonanz-spektroskopische Studie an verschiedenen Biosensoroberflächen Charakterisierung von Protein-Peptid- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen Torsten Fischer. [Forschungszentrum Jülich, Institut für Biologische Informationsverarbeitung] Jülich Forschungszentrum, Zentralbibliothek 2000 IX, 129 S. Ill., graph. Darst. : 30 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Berichte des Forschungszentrums Jülich 3839 Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2000. - Zsfassung in dt. und engl. Sprache Biosensor (DE-588)4193016-2 gnd rswk-swf NMR-Spektroskopie (DE-588)4075421-2 gnd rswk-swf Oberflächenplasmon (DE-588)4172251-6 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Oberflächenplasmon (DE-588)4172251-6 s NMR-Spektroskopie (DE-588)4075421-2 s Biosensor (DE-588)4193016-2 s DE-604 Berichte des Forschungszentrums Jülich 3839 (DE-604)BV004194732 3839 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009435348&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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