Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae:
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A. ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 3
B. EINLEITUNG ' 5
1. TAXONOMIE 5
2. MORPHOLOGIE, AUFBAU UND STRUKTUR 5
3. PATHOGENITAET UND VIRULENZ 7
4. VAKZINE GEGEN
HAEMOPHILUS INFLUENZAE 11
5. BIOSYNTHESE UND RECYCLING VON NAD - 14
5.1 DIE BIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON NAD 14
5.2 DIE SYNTHESE VON NAD 16
5.3 DIE AUFNAHME VON NAD 18
5.4
PASTEURELLACEAE UND FAKTOR V 19 -
6. ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 20
C. MATERIAL 21
1. BAKTERIENSTAEMME 21
1.1
ESCHERICHIA CO//-STAEMME 21
\ .2 H. INFLUENZAE-STAEMME
21
2. PLASMIDE, OLIGONUKLEOTIDE UND ANTIKOERPER 22
2.1 PLASMIDE YY' 22
2.2 OLIGONUKLEOTIDE 23
2.3 ANTIKOERPER 24
3. CHEMIKALIEN, KITS UND GERAETE 24
3.1 LABORKITS 25
3.2 GERAETELISTE 25
4. MEDIEN, AGAR UND MEDIENZUSAETZE 26
4.1 MEDIEN 26
4.2 AGAR 27
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4.3 MEDIENZUSAETZE 28
D. METHODEN 30
1. KULTIVIERUNG VON
H.
INFLUENZAE 30
2. ERSTELLEN EINER WACHSTUMSKURVE 30
3. MOLEKULARGENETISCHE METHODEN * 30
3.1 PLASMIDISOLIERUNG 30
3.2 PRAEPARATION VON CHROMOSOMALER DNA 31
3.2.1 PRAEPARATION DER CHROMOSOMALEN DNA 31
3.2.2 FREISETZEN DER CHROMOSOMALEN DNA DURCH AUFKOCHEN 31
3.3 SPALTUNG DER DNA MIT HILFE VON RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 31
3.4 HORIZONTALE GELELEKTROPHORESE 32
3.5 ELUTION VON NUKLEINSAEUREN AUS AGAROSEGELEN 32
3.6 SOUTHERN BLOT ANALYSEN 33
3.7 LIGATION 34
3.8 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN ZUR DNA TRANSFORMATION 34
3.8.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER
E. COLI-ZELLEN FUER DIE ELEKTROPORATION 34
3.8.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER
H. INFLUENZAE-ZELLEN 34
3.9 TRANSFORMATION KOMPETENTER ZELLEN MIT CHROMOSOMALER UND PLASMID-DNA
35
3.9.1 TRANSFORMATION VON CO/Z-ZELLEN 35
3.9.1 TRANSFORMATION VON
H. INFLUENZAE-ZELLEN 35
3.9.2.1 TRANSFORMATION VON MIV-KOMPETENTEN
H. INFLUENZAE-ZD\EN 35
3.9.2.2 TRANSFORMATION VON
H. INFLUENZAE BRAD 36
3.10 PCR-ANALYSEN 36
3.11 SEQUENZIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN MIT LI-COR 37
4. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 37
4.1 GEWINNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN 37
4.1.1 PRAEPARATION DES GESAMTZELLEXTRAKT 37
4.1.2 PRAEPARATION VON AUSSENMEMBRANPROTEINEN 38
4.1.2.1 KLEINER MASSSTAB 38
4.1.2.2 GROSSER MASSSTAB 38
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.3 PRAEPARATION DES PERIPLASMA-EXTRAKTES 38
4.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION MIT DEM D
C PROTEIN ASSAY (BIORAD) 39
4.3 AUFTRENNUNG DER PROTEINE DURCH SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 39
4.4 SILBERFARBUNG VON SDS-POLYACRYLAMIDGELEN 40
4.5 TROCKNEN VON SDS-POLYACRYLAMIDGELEN 40
4.6 IMMUNOBLOT (WESTEMBLOT)
YY
40
5. PHOSPHATASE-ASSAYS 41
5.1 NACHWEIS DER PHOSPHATASE-REAKTION MIT PNPP 41
5.2 DER MALAT-ENZYM-ASSAY 41
6. HERSTELLUNG DES RADIOAKTIV MARKIERTEN FAKTOR V 42
7. TRANSPORT-ASSAY - 42
8. DUENNSCHICHT-CHROMATOGRAPHIEN 42
9. STAMMKONSTRUKTIONEN 43
9.1 KONSTRUKTION VON /JCZ-DELETIONSMUTANTEN IN DEN
H. INFLUENZAE-STAEMMEN
REU0\2(AHEL::KAN),
REI1012B(AHEL::KAN), GK06(AHELV.KARI) UND
GK07
(AHEL::KAN) 43
9.2 KONSTRUKTION VON AJA-KNOCKOUT-MUTANTEN IN DEN
H. INFLUENZAE-STAEMMEN
REI 101
Q(NADN::CAT), REI 101 OB(NADN::CAT), JSB02(NADN::CAT) UND
JSB01
(NADNV.CAT) 44
E. ERGEBNISSE 45
1. DIE ROLLE VON
E(P4) BEI DER HAEMINAUFNAHME 45
1.1 KONSTRUKTION DER /?E/-DELETIONSMUTANTE REI 1012(A
HEI:: KAN) 45
1.2 DIE WACHTUMSPHAENOTYPEN DER /?E/-DELETIONSMUTANTE REI 1012(A
HELV.KAN) 46
2. NACHWEIS DER PHOSPHATASE-FUNKTION VON E(P4) 47
2.1 NACHWEIS DER PHOSPHATASE-AKTIVITAET VON E(P4) AUF INDIKATORPLATTEN 48
2.2 NACHWEIS DER PHOSPHATASE-AKTIVITAET VON
E(P4) MIT DEM PNPP-ASSAY 49
2.3 BESTIMMUNG DES PH-OPTIMUMS VON E(P4) 49
3. IDENTIFIZIERUNG DES PHYSIOLOGISCH RELEVANTEN SUBSTRATS VON E(P4) 50
3.1 DEPHOSPHORYLIERUNG DES FAKTORS V DURCH E(P4) 50
3.1.1 NAD, NMN UND NR ALS SUBSTRAT FUER
E{P4) 50
III
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.2 NACHWEIS DER DEPHOSPHORYLIERUNG VON NADP
MIT DEM MALAT-ENZYM-ASSAY 52
3.2 DIE WACHSTUMSPHAENOTYPEN DER MUTANTE
REMQ\2(AHEL\:KARI) 53
3.3 AUFNAHME VON
14C-NAD, 14C-NMN UND 14C-NR IN REI1012(AA ?/::FAW) 55
4. IST DIE PHOSPHATASE-FUNKTION VON E(P4) AN DIE LOKALISIERUNG AN DER
AUSSENMEMBRAN GEKOPPELT? ' 57
4.1 KONSTRUKTION DER CYSTEIN-MUTANTEN GK08(/IC/C2IC)
UND GK09(/2E/C2IO) 57
4.2 NACHWEIS DER PHOSPHATASE-AKTIVITAET IN DEN MUTANTEN GK08(/2(?/
C2IG)
UND GK09(M
C2IG) 60
5. IDENTIFIZIERUNG WEITERER PUTATIVER FUNKTIONEN VON E(P4) 60
5.1 KONSTRUKTION DER PHOSPHATASE-MUTANTE GK02(/?E/
DFGT) 61
5.2 NACHWEIS DES VERLUSTS DER PHOSPHATASE-FUNKTION VON E(P4)
IN DEN MUTANTEN GK02(/2T
J/D86L) UND GK03(/?E/D84A) 62
5.3 DIE WACHSTUMSPHAENOTYPEN DER MUTANTEN GK02
(HELM( I) UND GK03(/IE/D84A) 63
5.4 AUFNAHME VON
L4C-NAD, L4C-NMN UND 14C-NR
IN GK02(/?E/
D86L) UND GK03(/IE/DG4A) 65
6. WEITERE PROTEINE, DIE AN DER NAD-AUFNAHME VON
H. INFLUENZAE BETEILIGT SIND 66
6.1 DAS PERIPLASMATISCHE PROTEIN NADN VON
H. INFLUENZAE 66
6.1.1 KONSTRUKTION DER AC/V-KNOCKOUT-MUTANTE
REI
1010(NADNWCAT) 67
6.1.2 NACHWEIS DER SPALTUNG VON NAD UND NMN DURCH NADN 68
6.1.3 NACHWEIS DER SPALTUNG VON NADP DURCH NADN MIT DEM
MALAT-ENZYM-ASSAY 69
6.1.4 DIE WACHSTUMSPHAENOTYPEN DER MUTANTE REI
W\0(NADN::CAT) 70
6.1.5 AUFNAHME VON
14C-NAD, 14C-NMN UND 14C-NR IN REI1010(NADNV.CAT) 72
6.2 DIE DOPPELMUTANTE GK04
{NADNV.CAT AHEL::KAN) 74
6.2.1 KONSTRUKTION DER DOPPELMUTANTE
GK04(NADN::CAT NHELV.KARI) 74
6.2.2 DIE WACHSTUMSPHAENOTYPEN DER DOPPELMUTANTE 76
6.2.3 AUFNAHME VON
14C-NAD, 14C-NMN UND 14C-NR
IN
GK04(NADN::CAL AHEHKAN) 78
7. INHIBITOREN DER NAD-AUFNAHME VON
H, INFLUENZAE RD 79
8. FAKTOR V-NUTZUNG IN PATHOGENEN
H, INFLUENZAE-SLAEMMEN 79
IV
INHALTSVERZEICHNIS
8.1 DAS LIPOPROTEIN E(P4) IN PATHOGENEN
H. INFLUENZAE-STAEMMEN 80
8.2 NADN IN PATHOGENEN
H. INFLUENZAE-STAEMMEN 81
9. DAS AUSSENMEMBRANPROTEIN OMPP2 83
9.1 KONSTRUKTION DER OW/?.P2-DELETIONSMUTANTE GK05(A
OMPP2::CAT) 83
9.2 DIE WACHSTUMSPHAENOTYPEN DER OWPP2-DELETIONSMUTANTE
GK05(A
OMPP2::CAT) ' 86
9.3 AUFNAHME VON
L4C-NAD, 14C-NMN UND L4C-NR IN GK05(AOMPP2::CAT) 87
F. DISKUSSION 89
1. DIE ROLLE VON E(P4) BEI DER HAEMINAUFNAHME 89
2. DIE RELEVANZ VON E(P4) BEI DER NAD-NUTZUNG VON
H. INFLUENZAE 90
3. DIE ROLLE VON E(P4) BEI DER NAD-NUTZUNG VON
H. INFLUENZAE 91
4. DAS PROTEIN NADN UND DIE DOPPELMUTANTE 94
5. DAS AUSSENMEMBRANPROTEIN OMPP2 96
6. DIE NUTZUNG VON NAD BEI
H. INFLUENZAE 96 "
7. DIE VERBREITUNG VON E(P4) UND NADN UND DEREN RELEVANZ FUER DIE
PATHOGENITAET
VON
H. INFLUENZAE 97
G. LITERATURVERZEICHNIS 101
ANHANG 110
1. SEQUENZHOMOLOGIEN 110
2. ABKUERZUNGEN 111
3. ERKLAERUNGEN 113
4. PUBLIKATIONEN 114
5. LEBENSLAUF 115
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