Identifizierung und Charakterisierung neuronaler Autoantigene bei Patienten mit Tumoren und paraneoplastischen neurologischen Syndromen:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.VI
TABELLENVERZEICHNIS.VIII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.IX
1 EINLEITUNG. 2
1.1 IMMUNITAET.2
1.2 AUTOIMMUNITAET.4
1.3 NEUROLOGISCHE AUTOI
MMUNKRANKHEITEN.8
1.4 KLASSIFIZIERUNG VON PARANEOPLASTISCHEN NEUROLOGISCHEN SYNDROMEN.10
1.5 YYIMMUNDIAGNOSE" DER PNS.14
1.5.1 ANTI-HU. 14
1.5.2 ANTI-YO.1.15
1.5.3 ANTI-VGCC (VOLTAGE-GATED-CALCIUM-CHANNEL).16
1.5.4 ANTI-RI.16
1.5.5 ANTI-AMPHIPHYSIN.17
1.5.6 ANTI-VGKC (VOLTAGE-GATED-[K
+] POTASSIUM-CHANNEL).18
1.5.7 ANTI-RECOVERIN.18
1.5.8 ANTI-TR.19
1.5.9 ANTI-TITIN.19
1.5.10 ANTI-MA.20
1.5.11 ANTI-CV2.20
1.6 BEDEUTUNG DER IDENTIFIZIERUNG NEUER PARANEOPLASTISCHER
AUTOANTIKOERPER UND
ZIELSETZUNG DER ARBEIT.22
2 MATERIAL UND METHODEN.23
2.1 MATERIALIEN.23
2.1.1 CHEMIKALIEN.
;.23
2.1.2 OLIGONUKLEOTIDE, PEPTIDE. 23
2.1.3 GEBRAUCHSWAREN.24
2.1.4 ANTIKOERPER.24
2.1.5 PUFFER UND LOESUNGEN.25
2.1.5.1 PUFFER FUER DIE ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.26
2.1.5.2 LOESUNGEN FUER DIE GELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN.26
2.1.5.3 HYBRIDISIERUNGSLOESUNGEN.26
2
.
1
.
5
.
3.1
ALKPHOS DIRECT SYSTEM.
26
2
.
1
.
5
.
3.2
DIGDNA LABELLING ANDDETECTION SYSTEM.
27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/961445238
II
2.1.5.4 PUFFER FUER DIE DNA-SEQUENZIERUNG.27
2.1.5.5 PUFFER FUER DIE PROTEINISOLIERUNGEN.27
2.1.5.6 PUFFER FUER DIE ISOLIERUNG IMMUNGLOBULINE G AUS HUMANEN SEREN.28
2.1.5.7 PUFFER FUER DIE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE VON
PROTEINEN.28
2.1.5.8 PUFFER FUER DEN WESTERN-BLOT.28
2.1.5.9 PUFFER FUER DIE ISOELEKTRISCHE FOKUSIERUNG VON SERUM UND
LIQUORPROTEINE.29
2.1.5.10 PUFFER FUER DEN AFFINNITAETSBLOT.29
2.1.5.11 PUFFER FUER ELISA.29
2.1.5.12 PUFFER FUER DIE SUPERFUSION.'.29
2.1.5.13 PUFFER FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE UND
IN SITU HYBRIDISIERUNG.29
2.1.6 MEDIEN UND ANZUCHTBEDINGUNGEN.30
2.1.7 PLASMIDE UND VEKTOREN.31
2.1.8 BAKTERIENSTAEMME.32
2.1.9 ZELL-LINIEN.33
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.34
2.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.34
2.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA.34
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA MIT DEM YYQIAGEN PLASMID-KIT"
(QIAGENSAEULE 500) 34
2.2.2.2 SCHNELLISOLIERUNG VON PLASMID-DNA NACH DER
YYMBRISCREEN"-METHODE.35
2.2.3 ISOLIERUNG VON GESAMT-DNA AUS HUMANEM GEWEBE ODER ZELL-LINIEN NACH
DEM
YYPEQ-LAB E.Z.N.A TISSUE DNA II" ISOLIERUNGSPROTOKOLL.35
2.2.4 ISOLIERUNG VON X,-PHAGEN DNA.36
2.2.5 BESTIMMUNG DES PHAGENTITERS.36
2.2.6 AUSPLATTIEREN VON PHAGEN ZUM SCREENING EINER
EXPRESSIONS-GEN-BANK.37
2.2.7
IN VIVO EXCISION DES PBLUESCRIPT PHAGEMIDS AUS DEM K-ZAP VEKTOR.37
2.2.8 RESTRIKTIONSENZYM-SPALTUNG VON DNA.38
2.2.9 PHOSPHATASEBEHANDLUNG RESTRIKTIONSGESPALTENER VEKTOR-DNA.38
2.2.10 GELELEKTROPHORESE VON DNA.39
2.2.11 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN MIT DEM QIAEX II
GELEXTRAKTIONS-KIT.
,T.39
2.2.12 LIGATION VON PLASMID-DNA.39
2.2.13 HERSTELLUNG KOMPETENTER
E.COLI-ZELLEN.40
2.2.13.1 CACL2-METHODE.40
2.2.13.2 CACL
2-METHODE ZUR LANGZEITLAGERUNG KOMPETENTER ZELLEN.40
2.2.14 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN
E. COLI-ZELLEN.40
2.2.15 HERSTELLUNG VON
EB4-PLATING-CELLS.41
2.2.16 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR).41
2.2.17 TRANSFER VON DNA AUF EINE NYLONMEMBRAN (SOUTHEM-BLOT).42
III
2.2.18 HYBRIDISIERUNG FILTERGEBUNDENER NUKLEINSAEUREN MIT EINER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN SONDE.42
2.2.19 HYBRIDISIERUNG FILTERGEBUNDENER NUKLEINSAEUREN MIT EINER NICHT
RADIOAKTIV MARKIERTEN
SONDE.43
2.2.19.1 HYBRIDISIERUNG FILTERGEBUNDENER NUKLEINSAEUREN MIT DIG-MARKIERTE
SONDEN
(BOEHRINGER).43
2.2.19.2 HYBRIDISIERUNG FILTERGEBUNDENER NUKLEINSAEUREN MIT ALKALISCHE
PHOSPHATASE
MARKIERTE SONDEN (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH).44
2.2.20 DNA-CYCLE-SEQUENCING NACH DER DIDESOXYTEFMINATIONSMETHODE.45
2.2.21 ELEKTROPHORESE UND DIRECT-BLOTTING VON SEQUENZIERREAKTIONEN.45
2.2.22 IMMUNOFAERBUNG DER SEQUENZIERMEMBRANE.46
2.2.23 ISOLIERUNG GESAMTER RNA AUS TIERISCHEN ZELLEN UND GEWEBE.47
2.2.24 REVERSE TRANSKRIPTION UND POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR).47
2.2.25 GELELEKTROPHORESE VON RNA UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN.47
2.3 BIOCHEMISCHE METHODEN. 48
2.3.1 PRAEPARATION VON PROTEINROHEXTRAKTEN AUS HUMANEM ZNS.48
2.3.2 EXPRESSION UND REINIGUNG REKOMBINANTER PROTEINE AUS E.COLI.49
2.3.3 IMMUNGLOBULIN G ISOLIERUNG AUS HUMANEN SEREN.51
2.3.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINLOESUNGEN.51
2.3.5 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) VON PROTEINEN.52
2.3.6 WESTERN-BLOT, TRANSFER VON PROTEINEN AUS POLYACRYLAMID-GELEN AUF
NITROCELLULOSEMEMBRAN.53
2.3.7 IMMUNOFAERBUNG DER BLOTMEMBRANE.53
2.3.8 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA).53
2.3.9 IMMUNHISTOCHEMIE.54
2.3.10
IN SITU HYBRIDISIERUNG.55
2.3.11 IMMUNISIERUNG ZUR HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER.57
2.3.12 TESTEN DER WIRKUNG VON SEREN AUF DIE FUNKTION DES NMDA-REZEPTOR
MITTELS
SUPERFUSIONSEXPERIMENTEN.58
2.3.13 BERECHNUNGEN UND STATISTIK./.59
3 ERGEBNISSE. 62
3.1 IDENTIFIZIERUNG DER ANTI-DU/LOOKD ANTIKOERPER.62
3.1.1 WESTERN BLOT-ANALYSE MIT DEM ANTI-DU/1 OOKD SERUM.65
3.1.2 NACHWEIS DES 1 OOKD ANTIGENS IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN UND
ZELL-LINIEN.65
3.1.3 IMMUNHISTOCHEMISCHE ANALYSE MIT DEM ANTI-DU/1 OOKD SERUM.67
3.1.4 IMMUNOLOGISCHE DURCHMUSTERUNG
(SCREENING) DER HUMANEN ZEREBELLAEREN X.-ZAP
EXPRESSION-LIBRARY MIT DEM PATIENTENSERUM 1.69
IV
3.1.5 RESTRIKTIONSANALYSE DER ISOLIERTEN PHAGEN-DNA DER KLONE HUI,
HU2,HU3 UND
HU4.72
3.1.6
IN VIVO EXCISION DER PHAGEMIDE HUL-HU4.73
3.1.7 SOUTHERN HYBRIDISIERUNG HUMANER GENOMISCHER DNA MIT DEM KLON
HU2.75
3.1.8 ANSEQUENZIERUNG DER INSERTS HUI, HU2, HU3, HU4.75
3.1.9 UNTERSUCHUNGEN DES LAC-Z/DUL FUSIONPROTEINS.77
3.1.10 UNTERSUCHUNG DER WIRKUNG DES ANTI-DU/LOOKD SERUMS AUF DIE
N-METHYL-D-
ASPARTAT (NMDA)-REZEPTOREN MITTELS SUPERFUSIONSEXPERIMENTE.77
3.1.10.1 NMDA-REZEPTOR-VERMITTELTE FREISETZUNG VON [
3H]-ACH.80
3.1.10.2 WIRKUNG EINES KONTROLLSERUMS AUF DIE NMDA-REZEPTORFUNKTION.81
3.1.10.3 WIRKUNG DER PATIENTENSEREN AUF DIE FUNKTION DES
NMDA-REZEPTORS.82
3.1.11 UNTERSUCHUNG AUF DAS VORHANDENSEIN EINES MOEGLICHEN EPITOPS.83
3.2 IDENTIFIZIERUNG DER ANTI-FI/70KD ANTIKOERPER.85
3.2.1 NACHWEIS DES 70KD ANTIGENS IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN UND
ZELL-LINIEN.85
3.2.2 IMMUHISTOCHEMISCHE ANALYSE MIT DEM ANTI-FI/70KD SERUM.88
3.2.3 IMMUNOLOGISCHES
SCREENING EINER HUMANEN ZEREBELLAREN X-ZAP EXPRESSION-
LIBRARY
MIT DEM ANTI-FI/70KD SERUM. 90
3.2.4 RESTRIKTIONSANALYSE DER ISOLIERTEN PHAGEN-DNA DER KLONE YO 1, YO2,
YO3.91
3.2.5
IN VIVO EXCISION DER PHAGEMIDE UND CHARAKTERISIERUNG DER INSERTS YOL,
YO2 UND
YO3.92
3.2.6 ANSEQUENZIERUNG DER YOL, YO2 UND YO3 INSERTS.93
3.2.7 SEQUENZIERUNG DES YO3 KLONS.94
3.2.8 SOUTHERN HYBRIDISIERUNG HUMANER GENOMISCHER DNA MIT DEM KLON
YO3.98
3.2.9 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DES FI 1 -GENS IN DEN VERSCHIEDENEN
GEWEBEN UND
ZELLEN.98
3.2.10
IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT DER YO3.1 -SONDE.101
3.2.11 UMKLONIERUNG DER FI 1 -CDNA IN EINEM EXPRESSIONS VEKTOR,
REKOMBINANTE
EXPRESSION UND REINIGUNG DES REKOMBINANTEN PROTEINS.103
3.3 IDENTIFIZIERUNG DER ANTI-WI/55KD ANTIKOERPER.108
3.3.1 NACHWEIS DES 55 KD ANTIGENS IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN UND
ZELL-LINIEN.108
3.3.2 IMMUNHISTOCHEMISCHE ANALYSE MIT DEM ANTI-WI/55KD SERUM.110
3.3.3 IMMUNOLOGISCHES SCREENING EINER ZEREBELLAEREN
A.-ZAP-EXPRESSIONSGENBANK MIT
DEM SERUM DES PATIENTEN.111
3.3.4 RESTRIKTIONSANALYSE DER ISOLIERTEN PHAGEN-DNA DER KLONE WIL UND
W2.112
3.3.5
IN VIVO EXCISION DER PHAGEMIDE UND CHARAKTERISIERUNG DER INSERTS WIL UND
WI2 114
3.3.6 ANSEQUENZIERUNG DER INSERTS WIL UND WI2.114
3.3.7 SOUTHERN HYBRIDISIERUNG HUMANER GENOMISCHER DNA MIT DER WI 1 - UND
WI2-
SEQUENZ.116
V
3.3.8 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION DER WI 1 UND WI2 GENEN IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN UND ZELL-LINIEN.118
3.3.9 UMKLONIERUNG DER WI2-CDNA IN EINEM EXPRESSIONSVEKTOR, REKOMBINANTE
EXPRESSION UND REINIGUNG DES REKOMBINANTEN PROTEINS.119
3.3.10 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON POLYKLONALEN ANTI-WI2
ANTISEREN.122
3.3.11 DAS POLYKLONALE RA-WI2 SERUM ERKENNT EIN CA. 55 KD PROTEIN IM
PROTEINEXTRAKT
AUS KLEINHIRN UND GROSSHIRN.124
4 DISKUSSION.,.126
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER ANTI-DU/LOOKD ANTIKOERPER UND DES LOOKD
ANTIGENS.128
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER ANTI-FI/70KD ANTIKOERPER UND DES 70KD
ANTIGENS.131
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER ANTI-WI/55KD ANTIKOERPER UND DES 55KD
ANTIGENS.134
5 ZUSAMMENFASSUNG.136
6 LITERATURVERZEICHNIS.138
7 ANHANG.153
SEQUENZANALYSE 1.153
SEQUENZANALYSE 2.156
SEQUENZANALYSE 3. 158
SEQUENZANALYSE 4.161
SEQUENZANALYSE 5.171
SEQUENZANALYSE 6.172
SEQUENZANALYSE 7.174
SEQUENZANALYSE 8.177
ERMITTELTE MITTLERE TRITIUMABGABE BEI DER 1. UND 2. STIMULATION.179
DANKSAGUNG.181
LEBENSLAUF.182 |
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