Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Hsp90: Beschleunigung des Kerntransportes von 60S ribosomalen Untereinheiten
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG L
1.1 FUNKTIONEN DES ZELLKERNS 1
AUFBAU DES ZELLKERNS 1
STRUKTUR DES KERN PORENKOMPLEXES 2
DER KERN PORENKOMPLEX BESITZT EINE FLEXIBLE STRUKTUR 4
RIBOSOMEN WERDEN IM NUCLEOLUS GEBILDET 4
1.2
MECHANISMEN FUER DEN TRANSPORT ZWISCHEN ZELLKERN UND CYTOPLASMA 6
NUUEEAR LOCALIZATION SIGNALS X 6
NUDEAR EXPORT SIGNALS 7
NUDEAR SHUTTIING SIGNALS .7
EXPORT- UND IMPORT-REZEPTOREN VERMITTELN DEN KONTAKT ZUM NPC 7
FUER EINIGE SIGNALE GIBT ES SPEZIFISCHE ADAPTER-PROTEINE 8
EXPORT-MEDIATOREN FUER MRNA UND TRNA 9
DER RAN-ZYKLUS KOORDINIERT DIE BINDUNGEN DER TRANSPORT-REZEPTOREN ZU
DEREN
SUBSTRATEN 9
DIE PASSAGE DES NPCS IST NICHT DIREKT MIT EINEM ENERGIEVERBRAUCHENDEN
SCHRITT
GEKOPPELT 11
ALTERNATIVE TRANSPORTMECHANISMEN 11
DER WEG AUS DEM ZELLKERN - EXPORT RIBOSOMALER UNTEREINHEITEN 11
MESSUNGEN MIT ISOLIERTEN ZELLKERNEN 11
MESSUNGEN MIT WIEDERVERSIEGELTEN KEMMEMBRANEN 12
MIKROINJEKTION IN ZELLKERNE VON
XENOPUS /AEWS-OOZYTEN 12
MESSUNGEN MIT DER HEFE SACCHAROMYCES CEREVISIAE 13
1.3
HITZE-SCHOCK PROTEINE UND KERN-CYTOPLASMA-TRANSPOERT 13
HSP70/HSC70: HILFE BEI DER ASSEMBLIERUNG VON TRANSPORTKOMPLEXEN? 13
HSP90: EIN UNIVERSELLES PROTEIN 14
1.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 16
2 ERGEBNISSE
17
2.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON HSP90 17
ISOLIERUNG VON HSP90 AUS RATTENHEPATOZYTEN 17
IDENTIFIZIERUNG VON HSP90 17
QUANTIFIZIERUNG DES VERHAELTNISSES VON HSP90O ZU HSP90SS 19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 21
EXPRESSION VON HSP90 IN BAKTERIEN 21
EXPRESSION WEITERER PROTEINE IN BAKTERIEN 23
2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTIONALITAET VON HSP90 24
NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 24
UNTERSUCHUNG DER DIMER- BZW. OLIGOMERBILDUNG DURCH CROSS-LINKING 25
EINFLUSS VON CA
2+, MG2+, MO042', GELDANAMYCIN UND NOVOBIODN AUF DIE DIMER-
BZW. OLIGOMERBILDUNG
V 26
PHOSPHORYLIERNG VON HSP90 31
AUTOPHOSPHORYLIERUNG 31
PHOSPHORYLIERUNG DURCH KINASEN 34
CASEIN-KINASE II 35
MITOGEN-AKUE'VIERTE PROTEIN KINASE ERK2 35
CALMODULIN-ABHAENGIGE PROTEIN KINASE N 35
INTERAKTION VON HSP90 MIT ANDEREII PROTEINEN 38
2.4 LOKALISIERUNG VON EGFP-HSP90A IN 3T3-ZELLENRANSPORTMESSUNGEN 43
2.5 TRANSPORTMESSUNGEN MIT WIEDERVERSIEGELTEN KERNMEMBRANEN (NE-VESIKEL)
46
ISOLIERUNG VON ZELLKERNEN AUS RATTENHEPATOCYTEN 46
PRAEPARATION DER NE-VESIKEL 46
CYTOSOLPRAE PARATION 46
NACHWEIS DER AUFNAHME VON HISTON 2B IN NE-VESIKEL 47
ZENTRIFUEGALFILTRATION 48
AUFNAHME VON HISTON 2B IN NE-VESIKEL IN ANWESENHEIT VON KORNPETITOREN 48
AUFNAHME VON HISTON 2B IN NE-VESIKEL IN ABHAENGIGKEIT VON DER HISTON 2B-
KONZENTRATION 49
EXPORTMESSUNGEN MIT WIEDERVERSIEGELTEN KERNMEMBRANEN (NE-VESIKEL) 50
NACHWEIS DES EINSCHLUSSES VON 60S-RIBOSOMALEN UNTEREINHEITEN IN
NE-VESIKEL 50
MESSUNG DES EXPORTES 60S RIBOSOMAIER UNTEREINHEITEN AUS NE-VESIKEL 51
DER EXPORT 60S RIBOSOMAIER UNTEREINHEITEN AUS NE-VESIKEL WIRD DURCH EINE
IMPORTIN SS-MUTANTE INHIBIERT / 51
LEPTOMYCIN B, EIN INHIBITOR DES NES-REZEPTORS, INTERFERIERT NICHT MIT
DEM
EXPORT VON 60S RIBOSOMALEN UNTEREINHEITEN AUS NE-VESIKEL 52
HSP90 STEIGERT DEN EXPORT VON 60S RIBOSOMALEN UNTEREINHEITEN AUS
NE-VESIKEL 53
EINFLUSS DER N-TERMINALEN DOMAENE UND DES HSP90A237-732-FRAGMENTES AUF
DEN EXPORT 60S RIBOSOMAIER UNTEREINHEITEN AUS NE-VESIKEL 57
3
DISKUSSION 61
3.1 IDENTIFIZIERUNG DER HSP90-DOPPELBANDE ALS HSP90A UND HSP90YFF 62
3.2 EXPRESSION VON HSP90 IN BAKTERIEN 62
3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTIONALITAET VON HSP90 63
INHALTSVERZEICHNIS III
STRUKTURELLE ORGANISATION VON HSP90 63
PHOSPHORYLIERUNG VON HSP90 66
PHOSPHORYLIERUNG DURCH KINASEN 67
INTERAKTION MIT ANDEREN PROTEINEN 68
LOKALISATION VON HSP90 69
3.4 TRANSPORTMESSUNGEN MIT WIEDERVERSIEGELTEN KEMMEMBRANEN (NE-VESIKEL)
70
IMPORTMESSUNGEN MIT HISTON 2B 70
EXPORTMESSUNGEN MIT 60S RIBOSOMALEN UNTEREINHEITEN 72
3.5 MODELL FUER DIE BEDEUTUNG VON HSP90 BEI DEM EXPORT VON 60S
RIBOSOMALEN
UNTEREINHEITEN AUS DEM ZELLKERN 74
3.6 AUSBLICK
4 ZUSAMMENFASSUNG 77
\
5 MATERIAL UND METHODEN 79
5.1 VERWENDETE MIKROORGANISMEN, KULTIVIERUNG UND LAGERUNG '79
MIKROORGANISMEN 79
MEDIEN 79
ANTIBIOTIKA 79
HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 80
LAGERUNG 80
5.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 80
POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 80
PCR-PRIMER 81
PCR-REAKTIONSBEDINGUNGEN 81
PLASMIDISOLIERUNG 81
RESTRIKTION UND AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 82
DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSE-GELEN 82
LIGATION / 82
TRANSFORMATION 82
PLASMIDE/KONSTRUKTE 83
PROTEINETPRESSION 88
5.3 ZELLBIOLOGISCHE ARBEITEN 89
ZELLKULTUR 89
TRANSFEKTION 90
5.4 CYTOSOLPRAEPARATION AUS HEPATOZYTEN VON RATTEN 90
5.5 ISOLIERUNG VON HSP90 AUS RATTENLEBEM 90
ANIONEN-AUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE 91
GELFILTRATION 91
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.6 PROTEINMARKIERUNGEN 91
MARKIERUNGEN MIT FLUORESCEIN-5-MALEINIMID 91
MARKIERUNGEN MIT DEM RADIOISOTOP
125I 92
5.7 PRAEPARATION VON KANINCHEN-SERUM 92
5.8 HERSTELLUNG DES KERNEXTRAKTS 92
5.9
TRANSPORTMESSUNGEN AN WIEDERVERSIEGELTEN KEMMEMBRANEN 93
ISOLIERUNG VON ZELLKERNEN AUS RATBENHEPATOCYFEN 93
PRAEPARATION VON NE-VESIKELN AUS ZELLKERNEN 94
BELADUNG DER NE-VESIKEL MIT 60S RIBOSOMALEN UNTEREINHEITEN 94
TRANSPORTMESSUNGEN DURCH ZENTRIFUGALFILTRATION 94
AUFHAHMENACHWEIS VON HISTON 2B IN ZELLKERNE UND NE-VESIKEL %
EINSCHLUSSNACHWEIS 60S RIBOSOMALER UNTEREINHEITEN IN NE-VESIKEL 96
5.10 POLYACRYLAMIDGELEKTROPHORESE UND PROTEIN-RUECKELUTION 96
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE ^ - 96
PROTEIN-RUECKELUTION 97
CROSS-LINKING 98
PHOSPHORYLIERUNG VON HSP90 98
5.11 PROTEINSEQUENZIERUNGEN, WESTERN-BLOT, OVERLAY-BLOT 99
PROTEINSEQUENZIERUNGEN 99
WESTERN-BLOT 99
OVERLAY-BLOT ICK)
5.12 PROTEINBESTIMMUNG 100
5.13 MIKROSKOPIE 101
6 LITERATURVERZEICHNIS
102 |
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