Myelopoese embryonaler Stammzellen in vitro: Transkriptions-Kontrolle und Differenzierungsregulation durch CCAAT/Enhancer-bindende Proteine (C/EBPs)
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| Beschreibung: | Freiburg (Breisgau), Univ., Diss. 2001 |
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1 EINLEITUNG SEITE
1.1 DAS HAEMATOPOETISCHE SYSTEM DER VERTEBRATEN 1
1.2 EMBRYONALE STAMMZELLEN 5
1.3 DIE C/EBP-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN-FAMILIE 8
1.4 DAS LYSOZYMGEN DES HUHNS ALS MARKERGEN DER HAEMATOPOESE 13
1.5 ZIELE DER ARBEIT 17
2 ERGEBNISSE
2.1 EINFLUSS EINER TRANS-DOMINANT-NEGATIVEN C/EBP-VARIANTE AUF DIE
IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG VON ES-ZELLEN DER MAUS ZU MAKROPHAGEN 19
2.1.1 UNTERSUCHUNGEN MIT CHOP-BRM-EXPRIMIERENDEN ES-ZELLEN 19
2.1.2 IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG DER BRM-KLONE ZU MAKROPHAGEN 21
2.2 NACHWEIS DER C/EBPS IN ES-ZELLEN 24
2.2.1 VORARBEITEN AUS UNSERER ARBEITSGRUPPE 24
2.2.2 NACHWEIS DER C/EBPS IN ES-ZELLEN UND IN DEN ZELLEN DER
IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG 24
2.2.3 NACHWEIS DER C/EBPS UEBER IHRE DNA-BINDUNGSFAHIGKEIT 27
2.3 HERSTELLUNG DER ANTISENSE-C/EBP-ES-ZELLKLONE 29
2.3.1 KONSTRUKTION DER ANTISENSE-TRANSGEN-VEKTOREN 29
2.3.2 HERSTELLUNG DER C/EBP-AS UND -S ES-ZELLKLONE 31
2.4 NACHWEIS DER INTEGRIERTEN AS-TRANSGENE UND IHRER TRANSKRIPTIONS
PRODUKTE 34
2.4.1 ANALYSE DER INTEGRATION DER TRANSGEN-DNA 34
2.4.2 NACHWEIS DER ANTISENSE-RNA 38
2.5 IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG DER AS-RNA EXPRIMIERENDEN ES-ZELLKLONE 40
2.5.1 PHAENOTYPEN DER ES-ZELLKLONE IN DER IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG 40
2.5.2 VERGLEICH ALLER IN-VITRO-DIFFERENZIERUNGEN 49
2.5.3 LEBENSFAEHIGKEIT DER ZELLEN IN DER IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG 51
2.5.4 TOTIPOTENZ DER ES-ZELLEN 53
2.6 EXPRESSION DES HUEHNERLYSOZYM-MARKERGENS IN MAKROPHAGEN DER
AS-RNA-EXPRIMIERENDEN ZELLKLONE 54
2.6.1 NACHWEIS DER INTEGRATION DER HUEHNERLYSOZYMGENDOMAENE 54
2.6.2 S1 -ANALYSE DER EXPRESSION VON HUEHNERLYSOZYM-RNA 56
2.7 ETABLIERUNG EINES IN-VITRO-DIFFERENZIERUNGSSYSTEMS AUS ES-ZELLEN DER
MAUS ZU DENDRITISCHEN ZELLEN 57
2.7.1 DIFFERENZIERUNGSBEDINGUNGEN FUER DENDRITISCHE ZELLEN 57
2.7.2 IMMUNHISTOLOGISCHE IDENTIFIZIERUNG VON DCS 63
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/961112719
3 DISKUSSION
3.1 EXPRESSION DES DOMINANT-NEGATIVEN CHOP-BRM-PROTEINS 64
3.2 EXPRESSION VON C/EBPS IN ES-ZELLEN UND IN ZELLEN WAEHREND DER
IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG 65
3.3 TRANSFEKTION UND EXPRESSION DER ANTISENSE-RNA IN ES-ZELLEN 68
3.4 IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG DER AS-RNA-EXPRIMIERENDEN ZELLKLONE 68
3.5 AKTIVITAET DES HUEHNERLYSOZYM-TRANSGENS IN AS-RNA-EXPRIMIERENDEN
ZELLEN 73
3.6 IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG VON ES-ZELLEN ZU DENDRITISCHEN ZELLEN 75
3.7 MEDIZINISCHE RELEVANZ DER ERGEBNISSE 77
4 MATERIAL UND METHODEN
4.1 MATERIAL 79
4.1.1 ZELLEN 79
4.1.2 MATERIAL FUER DIE ZELLKULTUR 79
4.1.2.1 MEDIEN UND ZUSAETZE 79
4.1.2.2 ZYTOKINE 79
4.1.2.3 SONSTIGES ZELLKULTURMATERIAL 80
4.1.3 REAGENZIEN 80
4.1.3.1 CHEMIKALIEN 80
4.1.3.2 FEINCHEMIKALIEN 81
4.1.3.3 RADIOCHEMIKALIEN 81
4.1.3.4 STANDARDLOESUNGEN UND PUFFER 81
4.1.4 ENZYME ^ 82
4.1.5 NUKLEINSAEUREN UND PLASMIDE 82
4.1.6 ANTIKOERPER 83
4.1.7 KITS 83
4.1.8 SONSTIGES
/ 83
4.2 METHODEN 84
4.2.1 ALLGEMEINE ARBEITEN MIT DNA 84
4.2.1.1 ANALYTISCHE MINI-PLASMIDPRAEPARATION 84
4.2.1.2 PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG
UND REINIGUNG UEBER EINEN CSCL-GRADIENTEN 84
4.2.1.3 ETHANOLFALLUNG VON DNA 85
4.2.1.4 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEURE-KONZENTRATION 85
4.2.1.5 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA 85
4.2.1.6 ANALYTISCHE UND PRAEPARATIVE GELELEKTROPHORESE
VON NUKLEINSAEUREN 85
4.2.1.7 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 86
4.2.1.8 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS PAA-GELEN 86
4.2.1.9 DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID-DNA 86
4.2.1.10 LIGATION DER DNA-FRAGMENTE 86
4.2.2 ALLGEMEINE ZELLKULTURARBEITEN 86
4.2.2.1 KULTUR VON STO-FIBROBLASTEN 86
4.2.2.2 TRYPSINISIEREN VON ZELLEN 87
4.2.2.3 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 87
4.2.2.4 GELATINEBEHANDLUNG VON ZELLKULTURSCHALEN UND DECKGLAESERN 87
4.2.2.5 MITOMYCIN-BEHANDLUNG VON STO-FIBROPLASTEN
UND HERSTELLUNG DER YYFEEDER"-ZELLSCHICHT 88
4.2.2.6 HERSTELLUNG VON LIF-KONDITIONIERTEM MEDIUM 88
4.2.2.7. KULTUR VON ES-ZELLEN 88
4.2.2.8 SUBKLONIERUNG 88
4.2.3 IN-VITRO-DIFFERENZIERUNG 89
4.2.3.1 METHYLCELLULOSE-KULTUREN 89
4.2.3.2. UMPLATTIEREN DER KULTUREN WAEHREND DER
IN-VITRO-DIFFERENZIERUNGEN 89
4.2.3.3 KOLLAGENASE BEHANDLUNG VON EBS 90
4.2.3.4 HERSTELLUNG VON L-ZELL- ODER GM-CSF-KONDITIONIERTEM MEDIUM 90
4.2.3.5 HERSTELLUNG VON IL-3- ODER IL-4-KONDITIONIERTEM MEDIUM 90
4.2.3.6 HERSTELLI^G EINER 1.8%IGEN METHYLCELLULOSE-STAMMLOESUNG 90
4.2.3.7 HERSTELLUNG VON ZWEIFACH KONZENTRIERTEM IMDM 91
4.2.3.8. IN-SITU-SS-GALACTOSIDASE-FAERBUNG DER ES-ZELLEN UND
DIFFERENZIERTEN ZELLEN 91
4.2.3.9 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENS-FAERBUNG DER DIFFERENZIERTEN ZELLEN 91
4.2.3.10 PHAGOZYTOSEASSAY FUER MAKROPHAGEN 92
4.2.3.11 FAERBUNG VON TOTEN ZELLEN IN EBS 92
4.2.4 GENTRANSFEREXPERIMENTE 92
4.2.4.1 CALC IUM-PHOSPHAT-T RANSFEKTION 92
4.2.4.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON COS-ZELLEN 92
4.2.4.3 PRAEPARATION HOCHMOLEKULARER GENOMISCHE DNA 93
4.2.4.4 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA IN DER 96- ODER 24-LOCHPLATTE 93
4.2.4.5 YYSOUTHEM"-ANALYSE 94
4.2.4.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER HYBRIDISIERUNGSPROBE
DURCH YYRANDOM PRIME LABELLING" 94
4.2.4.7 PRAEPARATION GESAMTZELLULAERER RNA 94
4.2.4.8 RADIOAKTIVE ENDMARKIERUNG DER S1 -PROBEN 95
4.2.4.9 S1-ANALYSE 95
4.2.4.10 RT-PCR 96
4.2.5 ARBEITEN MIT PROTEINEN 97
4.2.5.1 SCHNELL-PRAEPARATIONSTECHNIK FUER KEMEXTRAKTE AUS SAEUGERZELLEN 97
4.2.5.2 KEMEXTRAKTE NACH DER NUN-METHODE ' 98
4.2.5.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BIO RAD 99
4.2.5.4 IMMUNBLOT UND DETEKTION 99
4.2.5.5 GELRETARDIERUNGSEXPERIMENT 100
5 ANHANG *1
6 LITERATURVERZEICHNIS * 09
7 ABKUERZUNGEN * 23
8 LEBENSLAUF *24 |
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