Suche nach differentiell exprimierten Genen und einer spezifischen Erregernukleinsäure bei Scrapie:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Friedland
Bielefeld
2000
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| Beschreibung: | Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2000 |
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| adam_text | Titel: Suche nach differentiell exprimierten Genen und einer spezifischen Erregernukleinsäure bei Scrapie
Autor: Riemer, Constanze
Jahr: 2000
-5-
Inhalt
1 Einleitung 8
2 Literaturübersicht 10
2.1 Geschichtlicher Hintergrund 10
2.2 Histopathologische Veränderungen 12
2.3 Eigenschaften des Krankheitserregers 12
2.4 Hypothesen zur Natur des Erregers 14
2.5 Das Präamyloidprotein-Gen (PrP-Gen) 15
2.6 Das Präamyloidprotein (PrP°) 17
2.7 Das Amyloidprotein (PrP^) 19
2.8 Diagnose von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien 19
2.8.1 Diagnose von Scrapie 20
2.8.2 Diagnose von BSE 20
2.8.3 Diagnose von CJD 20
2.9 Pathogenese 22
2.9.1 Ausbreitungsweg 22
2.9.2 Differentielle Genexpression 22
3 Problemstellung der Arbeit 25
4 Material und Methoden 26
4.1 Material 26
4.1.1 Chemikalien 26
4.1.2 Labortiere und Scrapie-Stämme 27
4.1.3 Trennmedien und Fertigkits 27
4.1.4 Enzyme 28
4.1.5 Antikörper 28
4.1.6 Nukleinsäuren 28
4.1.7 Radioaktive Verbindungen/Szuitiltatoren 29
4.1.8 Geräte und Utensilien 30
4.1.9 Puffer und Lösungen 30
4.2 Methoden 32
4.2.1 Sicherheitsmaßnahmen 32
4.2.2 Inaktivierung von Nukleasen 32
4.2.3 Vermehrung des Scrapie-Erregets 32
4.2.4 Anreicherung des Scrapie-Enegers 33
-6-
4.2.5 Nukleinsäure-Isolierung
4.2.6 cDNA-Synthese 35
4.2.7 Polymerase-K.ettenreaktion(PCR) 36
4.2.8 Sequenzierreaktion 38
4.2.9 Subtraktive Hybridisierungsmethoden 39
4.2.10 Phagenscreening 43
4.2.11 ArbitrarilypriniedPCR(AP-PCR) ^
4.2.12 Agarosegeleleklrophorese 46
4.2.13 Blot-Techniken 46
4.2.14 Radioaktive Markierung von DNA-Sonden 47
4.2.15 Hybridisiening und Autoradiographie 47
4.2.16 Quantifizierung von Nukleinsäuren 48
4.2.17 Restriktionsverdau 49
4.2.18 Ligation und Transformation 49
4.2.19 IP-10-ELISA 49
4.2.20 Dialysen 49
Ergebnisse 51
5.1 Identifizierung differentiell exprimierter Gene im Scrapie-infizierten
Hamstergehirn 51
5.1.1 Anreicherung überexprimierter cDNAs mit der suppressiven
subtraktiven Hybridisiening (SSH) 51
5.1.2 Screening der subtrahierten cDNA-Bank auf differentiell
exprimierte Klone 54
5.1.3 Identifizierung überexprimierter Gene 55
5.1.4 Bestimmung der Chemokin-Expression im Zeitverlauf 63
5.1.5 Bestimmung von IP-10 im Liquor 64
5.1.6 Suche nach Induktoren der gesteigerten Genexpression 65
5.2 Suche nach einer spezifischen Erregemukleinsäure im Scrapie-infizierten
Hamstergehim 66
5.2.1 Optimierung der cDNA-Synthese 67
5.2.2 Differential Screening 68
5.2.3 Modifikation und Prüfung verschiedener Subtraktionsmethoden zur
Anwendung auf das RNA/DNA-Gemisch der Erregerpräparationen 70
5.2.4 Arbitrarily primed PCR (AP-PCR) 76
-7-
Diskussion 78
6.1 Identifizierung von differentiell exprimierten Genen im Scrapie-infizierten
Hamstergehim 78
6.2 Erregersuche 84
Zusammenfassungen 89
7.1 Zusammenfassung 89
7.2 Summary 91
Literaturverzeichnis 93
Abbildungsverzeichnis 113
Abkürzungsverzeichnis 115
Sequenzen 117
- 113-
ABBDLDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1: Schematische Darstellung der suppressiven subtraktiven Hybridisierung
(modifiziert nach Diatchenko et al. 1996) 40
Abbildung 2: Schematische Darstellung der arbitrarily primed PCR (modifiziert nach
Cheratetal. 1996) 45
Abbildung 4: Agarosegelanalyse der cDNA-Synthesereaktion von mRNA aus
humaner Skelettmuskulatur (K), infiziertem (S) und
Kontrollgehirngewebe (N) sowie des nachfolgenden RSA I-Verdaus 52
Abbildung 5: Agarosegelanalyse der PCR- und nested-PCR-Produkte nach
suppressiver subtraktiver Hybridisierung 54
Abbildung 7: Autoradiographie eines Differential Screenings der subtrahierten
cDNA-Bank (Ausschnitt) 55
Abbildung 8: Autoradiographie der Northem-Blot-Analyse der veränderten
Genexpression im Hamstergehirn während einer Scrapie-Infektion 58
Abbildung 9: Vergleich der Aaünosäuresequenzen der Mx-Proteine 59
Abbildung 10: Vergleich der Aminosäuresequenzen von IP-10 62
Abbildung 11: Vergleich der Aminosäuresequenz von BLC 62
Abbildung 12: Bestimmung der Chemokin-Expression im Zeitverlauf nach Scrapie-
Infektion mittels RT-PCR 63
Abbildung 13: IP-10 ELISA mit Liquor von A: infizierten bzw. nicht infizierten
Hamstern und B: CJD-Patienten und gesunden Kontrollpersonen. 64
Abbildung 14: Bestimmung der Interferon-Expression im Zeitverlauf nach Scrapie-
Infektion mittels RT-PCR 65
Abbildung 15: Bestimmung der Chemokin-Expression im Zeitverlauf nach Scrapie-
Infektion mittels RT-PCR 66
Abbildung 16: Optimierung der cDNA-Synthese mit zirkulärer.Viroid-RNA (A)
und ß-Globin-RNA (B) 68
Abbildung 17: Agarosegelanalyse nach cDNA-Synthese des N- und S-
Nukleinsäuregemischs und nachfolgender PCR 69
Abbildung 18: Autoradiographie zweier identischer Abklatsche von Lambda-Plaques
(Ausschnitt) 69
Abbildung 19: Autoradiographie einer Dot-Biot-Analyse von vier DNA-Fragmenten
auf ihre Scrapie-Spezifität durch Hybridisierung gegen genomische
Hamster-DNA 70
Abbildung 20: Agarosegelanalyse des Ausgangsmaterials für die
Subtraktionshybridisierung nach cDNA-Synthese und PCR 71
Abbildung 21: Agarosegelanalyse der PCR-Produkte nach der 3. Subtraktion 72
Abbildung 22: Autoradiographie der Southern Blot-Hybridisierung zur Darstellung der
$X-Anreicherung im Subtraktionsverlauf 72
- 114-
Abbildung 23: Agarosegelanalyse nach cDNA-Synthese und PCR von mRNA aus
humaner Skelettmuskulatur (K) und der Nukleinsäure aus Erreger- (S)
und Kontrollpräparationen (N) sowie des nachfolgenden RSA 1-
Verdaus 74
Abbildung 24: Agarosegelanalyse der nested-PCR-Produkte nach suppressiver
subtraktiver Hybridisierung 75
Abbildung 25: Autoradiographie einer Sequenzgelanalyse der AP-PCR 77
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