Identifizierung und Charakterisierung regulatorischer Protein-Wechselwirkungen an den HI-Motiven im Promotor des lytischen Schaltgens BZLF1 von Epstein-Barr-Virus:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
IV
ZUSAMMENFASSUNG
1
1
EINLEITUNG
4
1.1
DAS
EPSTEIN-BARR-VIRUS
4
1.1.1
DIE
ENTDECKUNG
DES
EPSTEIN-BARR-VIRUS
4
1.1.2
DIE
FAMILIE
DER
HERPESVIREN
4
1.1.3
DIE
ASSOZIATION
DES
EPSTEIN-BARR-VIRUS
MIT
ERKRANKUNGEN
DES
MENSCHEN
7
1.2
STRUKTUR
UND
ORGANISATION
DES
EPSTEIN-BARR-VIRUS
11
1.2.1
AUFBAU
DES
VIRIONS
11
1.2.2
GENOMSTRUKTUR
12
1.3
DER
INFEKTIONSZYKLUS
DES
EPSTEIN-BARR-VIRUS
13
1.3.1
ADSORPTION
AN
DIE
ZELLMEMBRAN
13
1.3.2
PENETRATION
UND
UNCOATING
14
1.3.3
GENETISCHE
PROGRAMME
DES
EPSTEIN-BARR-VIRUS
14
1.4
DAS
IMMEDIATE-EARLY-GEN
BZLF1
22
1.4.1
DASBZLFL-GENPRODUKTZTA
23
1.4.2
REGULATION
DES
IMMEDIATE-EARLY-GENS
BZLF1
25
1.5
ZIELSETZUNG
30
2
MATERIAL
UND
METHODEN
32
2.1
BIOLOGISCHES
MATERIAL
32
2.1.1
BAKTERIENKULTUR
32
2.1.2
HEFEKULTUR
33
2.1.3
ZELLKULTUR
34
2.2
OLIGO-DESOXYNUKLEOTIDE
36
2.3
PLASMIDE
38
INHALTSVERZEICHNIS
2.4
ALLGEMEINE
METHODEN
41
2.4.1
CHEMISCHE
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
41
2.4.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
41
2.4.3
SCHNELLISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
42
2.4.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
42
2.4.5
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
43
2.4.6
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
44
2.4.7
ALLGEMEINE
ARBEITEN
MIT
DNA
44
2.4.8
POLYMERASE-KETTENREAKTION
45
2.4.9
SEQUENZSPEZIFLSCHE
DNA-MUTAGENESE
46
2.4.10
DNA-SEQUENZIERUNG
47
2.4.11
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
47
2.5
SPEZIELLE
METHODEN
50
2.5.1
GEL-RETENTLONSANALYSE
50
2.5.2
DAS
HEFE
ONE-HYZ RID-NACHWELSSYSTEM
54
2.5.3
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
63
3
ERGEBNISSE
71
3.1
IDENTIFIZIERUNG
HL-BINDENDER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
MIT
DEM
HEFE
ONE-HYBRID-NACHWEISSYSTEM
71
3.1.1
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
ZUR
ETABLIERUNG
SPEZIFISCHER
REPORTERSTAEMME
71
3.1.2
ERZEUGUNG
HL-SPEZIFISCHER
LACZ-REPORTERSTAEMME
72
3.1.3
AKTLVIERBARKEIT
HL-SPEZIFISCHER
LACZ-REPORTERSTAEMME
VOR
TRANSFORMATION
DER
FUSIONSGENBANK
73
3.1.4
GENBANK-SCREENINGHIOE-BINDENDERFUSIONSPROTEINE
74
3.1.4
GENBANK-SCREENING
HI
Y-BINDENDER
FUSIONSPROTEINE
-
IDENTIFIZIERUNG
EINES
E-BOX-MOTIVS
INNERHALB
DER
HI-MOTLVE
A,
SS
UND
Y
76
3.2
ETABLIERUNG
EINES
IN
VITRO-TRANSKRIPTIONS-SYSTEMS
80
3.2.1
ANWENDUNG
DER
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
IN
EINEM
FUNKTIONALEN
REPORTERSYSTEM
81
3.2.2
PRAEPARATION
TRANSKRIPTIONSAKTIVER
KERN-ROHEXTRAKTE
85
3.2.3
ETABLIERUNG
DER
IN
VITRO-TRANSKRIPTIONSREAKTION
88
3.2.4
ETABLIERUNG
EINES
AUF
DEM
BZLFL-PROMOTOR
ZP
BASIERENDEN
IN
VITRO
TRANSKRIPTIONS-NACHWEISES
91
3.3
ERGEBNISSE
DER
IN
VITRO-TRANSKRIPTIONS-ANALYSEN
93
3.3.1
HI-MUTATLONEN
BEWIRKEN
EINE
ABNAHME
DER
HOHEN
IN
VITRO
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
DES
BZLFL-PROMOTORS
93
3.3.2
IN
EPITHELIALEM
HELA-EXTRAKT
IST
EINE
GLEICHARTIGE
FUNKTION
DER
HL-ELEMENTE
WIE
IN
LYMPHOLDEM
BJAB-EXTRAKT
NACHWEISBAR
97
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3
IM
BEREICH
DES
HL-ELEMENTS
8
SIND
ZWEI
GEGENSAETZLICHE
PROMOTOR
FUNKTIONEN
IN
UNMITTELBARER
NACHBARSCHAFT
LOKALISIERT
99
3.3.4
DIE
VERMINDERTE
IN
W'FRO-TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
ALLER
GETESTETEN
HI-CORE-MUTATIONEN
VERDEUTLICHT
EINE
EINHEITLICHE
AKTIVIERENDE
HL-FUNKTION
102
3.4
BANDSHIFT-ANALYSE
DES
PROTEIN-BINDUNGSVERHALTENS
DER
HI
8-REGION
UND
DER
HI-CORE-SEQUENZEN
105
3.4.1
DIE
IN
DEN
TRANSKRIPTIONS-EXPERIMENTEN
GETESTETEN
MUTATIONEN
DES
HL-ELEMENTS
8
KORRELIEREN
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
IM
BANDSHIFT
106
3.4.2
SEQUENTIELLE
MUTATIONEN
VERDEUTLICHEN
DIE
LOKALISATION
ZWEIER
PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
AN
DER
5
"-REGION
VON
HI
8
109
3.4.3
NACHWEIS
EINER
SPEZIFISCHEN
YY
1-BINDUNG
IN
DER
5
"-REGION
VON
HI
8
112
3.4.4
BANDSHIFT-ANALYSEN
MIT
DEN
ISOLIERTEN
HL-CORE-SEQUENZEN
VERDEUTLICHEN
SPEZIFISCHE
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
HL-MOTIVE
118
4
DISKUSSION
123
4.1
DIE
FUNKTION
DES
EB-VIRALEN
GENS
BZLF1
IM
INFEKTIONSZYKLUS
DES
VIRUS
123
4.2
ETABLIERUNG
EINES
IN
VITRO-TRANSKRIPTIONS-ANSATZES
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
HL-REGULATORISCHER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
126
4.3
NACHWEIS
EINER
TRANSKRIPTIONSREGULIERENDEN
HL-FUNKTION
129
4.4
BANDSHIFT-ANALYSE
MOLEKULARER
WECHSELWIRKUNGEN
DER
HL-ELEMENTE
133
4.4.1
PROTEINBINDUNG
IM
5
"-BEREICH
DES
HL-ELEMENTS
8
134
4.4.2
PROTEINBINDUNG
IM
KEMBEREICH
DER
HL-ELEMENTE
139
4.5
BEWERTUNG
DER
ONE-HYBRID-GENBANK-ANALYSEN
141
4.5.1
HYPOTHETISCHE
BINDUNGSFAKTOREN
DER
HL-MOTIVE
Y
UND
8
143
4.5.2
PROTEINBINDUNG
AM
HL-MOTIV
8
143
4.5.3
PROTEINBINDUNG
AM
HL-MOTIV
Y
145
4.6
ZUSAMMENFASSENDE
BEWERTUNG
DER
ERGEBNISSE
UND
IHRER
BEDEUTUNG
FUER
DIE
HL-FUNKTION
147
LITERATURVERZEICHNIS
154
ANHANG
164
DANKSAGUNG
169
IN |
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