Funktionsanalyse von Rezeptoren, Elementen der Signalkette und des Effektors der Chemotaxis bei Sinorhizobium meliloti:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
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2000
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1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
11
2.1.
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
11
22.
HERKUNFT
VON
CHEMIKALIEN
UND
ENZYMEN
24
23.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
26
2.4.
MEDIEN
31
2.4.1.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
E.
COLI
31
2.4.2.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
S.
MELILOTI
32
2.4.3.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
S.
CEREVISIAE
33
25.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
33
2.5.1.
LOESUNGEN
FUER
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
33
2.5.2.
LOESUNGEN
FUER
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
OLIGONUKLEOTIDREINIGUNG
34
2.5.3.
LOESUNGEN
FUER
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
FUER
DNA-SEQUENZIERUNG
34
2.5.4.
LOESUNGEN
FUER
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
PROTEINAUFTRENNUNG
34
2.5.5.
LOESUNGEN
FUER
DIG-MARKIERUNGEN
UND
DETEKTION
35
2.5.6.
LOESUNGEN
FUER
PLASMIDISOLIERUNG
36
2.5.7.
LOESUNGEN
FUER
GENOMISCHE
DNA
ISOLIERUNG
AUS
S.
MELILOTI
36
2.5.8.
LOESUNGEN
FUER
DIE
RNA
ISOLIERUNG
AUS
S.
MELILOTI
36
2.5.9.
LOESUNGEN
FUER
PROTEINREINIGUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
36
2.5.10.
LOESUNGEN
FUER
PROTEINREINIGUNG
AUS
INCLUSION
BODIES
37
2.5.11.
LOESUNGEN
FUER
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
37
2.5.12.LOESUNGEN
FUER
TRANSFORMATION
VON
S.
CEREVISIAE
(LIAC-METHODE)
38
2.5.13.
LOESUNGEN
FUER
IFAS/ERN-HYBRIDISIERUNG
38
2.5.14.LOESUNGEN
FUER
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
38
2.5.15.
LOESUNGEN
FUER
DEN
/3-GALAKTOSIDASE
TEST
39
2.5.16.
SONSTIGE
PUFFER
39
3.
METHODEN
40
3.1.
ANZUCHT
UND AUFBEWAHRUNG
DER
VERWENDETE
ORGANISMEN
40
3.1.1.
ESCHERICHIA
COLI
KULTUREN
40
3.1.2.
SINORHIZOBIUM
MELILOTI
KULTUREN
40
3.1.3.
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
KULTUREN
40
32.
EINFUEHRUNG
VON
KONSTRUKTEN
BEI
S.
MELILOTI
MITTELS KONJUGATION
41
3.2.1.
KONJUGATION
ZUR
EINFUEHRUNG
VON
DELETIONEN
UND
INSERTIONEN
41
3.2.2.
KONJUGATION
ZUR
EINFUEHRUNG
VON
ZACZ-FUSIONEN
3.2.3.
ERZEUGUNG
EINER
ZACZ-MUTANTE
MITTELS
TN5
MUTAGENESE
42
33.
TRANSFORMATION
UND
TRANSFORMANTENANALYSE
43
3.3.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
43
3.3.2.
SELEKTION
UND
DIFFERENZIERUNG
TRANSFORMIERTER
E.
COLI-ZELLEN
43
3.3.3.
TRANSFORMATION
VON
S.
CEREVISIAE
43
3.4.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
44
3.4.1.
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
S.
MELILOTI
44
3.4.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
DNA
AUS
E.
COLI
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
44
3.4.3.
ISOLIERUNG
VON
PBKCMV-PHAGEMID
DNA
AUS
X.ZAP
EXPRESSYY-BAKTERIO
PHAGEN
(ZN
VIVO
EXCISION)
45
3.4.4.
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHEN
DNA-FRAGMENTEN
MITTELS
PLASMID-RESCUE
46
3.4.5.
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
S.MELILOTI
46
3.4.6.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
DURCH
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
46
3.4.7.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
UND
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
MITTELS
GENE-CLEAN
(GENE
CLEAN
II-KIT,
BIO
101)
47
3.4.8.
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
47
3.4.9.
OLIGONUKLEOTID-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
47
3.4.10.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
48
3.5.
ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG
VON
DNA
48
3.5.1.
SPALTEN
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
48
3.5.2.
BEHANDLUNG
VON
DNA-ENDEN
MIT
DER
DNA-POLYMERASE
DES
BAKTERIO
PHAGEN
T4
48
3.5.3.
BEHANDLUNG
VON
DNA-ENDEN
MIT
DER
KLENOW-POLYMERASE
48
3.5.4.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
3.5.5.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
49
3.5.6.
LIGIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
VEKTOR-DNA
49
3.5.7.
PCR-AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA
49
3.5.8.
PCR-MUTAGENESE
50
3.5.9.
KLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
DURCH
DISEC/TRISEC
51
3.5.10.5
'
RACE
ZUR
DETEKTION
VON
TRANSKRIPTIONSSTARTS
51
3.6.
DNA-SEQUENZANALYSE
52
3.6.1.
SEQUENZIERREAKTION
52
3.6.2.
SEQUENZ-GELELEKTROPHORESE
52
3.7.
HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
53
3.7.1.
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
(SOUTHERN
BLOT)
53
3.7.2.
TRANSFER
VON
PHAGEN-DNA
AUF
MEMBRANEN
(PLAQUE
LIFTING)
53
3.7.3.
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
53
3.7.4.
PRAEHYBRIDISIERUNG
UND
HYBRIDISIERUNG
54
3.7.5.
DETEKTION
DER
HYBRIDISIERENDEN
NUKLEINSAEURE
DURCH
CHEMILIUMINESZENZ
UND
AUTORADIOGRAPHIE
54
3.8.
GEWINNUNG REKOMBINANTER
CHEMOTAXISPROTEINE
AUS
E.COLI
55
3.8.1.
DAS
PQE-EXPRESSIONSSYSTEM
IN
E.COLI
ML5PREP4
55
3.8.2.
ANZUCHT
UND
AUFSCHLUSS
DER
ZELLEN
56
3.8.3.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
DURCH
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
56
3.8.3.1.
NATIVE
REINIGUNG
MIT
NI-NTA-MINI-SPIN-SAEULEN
56
3.8.3.2.
NATIVE
REINIGUNG
UEBER
NI-NTA-SEPHAROSE
56
3.8.3.3.
DENATURIERTE
REINIGUNG
AUS
INCLUSION
BODIES
MIT
NI-NTA-SEPHAROSE
57
3.9.
HERSTELLUNG
VON POLYKLONALEN
ATLPA
UND
AORF2-ANTIKOERPERN
57
3.10.
PROTEINANALYTIK
57
3.10.1.
GEWINNUNG
VON
DENATURIERTEN
PROTEINROHEXTRAKTEN
FUER
SDS-PAGE
57
3.10.1.1.
GESAMTZELLEXTRAKT
VON
E.
COZI-ZELLEN
57
3.10.1.2.
AUFSCHLUSS
FUER
UEBERSTAND
UND
PELLET
VON
E.
COZI-ZELLEN
58
3.10.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
58
3.10.3.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
58
3.10.4.
TRANSFER
AUFGETRENNTER
PROTEINE
AUF
NITROCELLULOSE-FILTER
(WESTERN
BLOT)
58
3.10.5.
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
DURCH
CHEMILUMINESZENZ
59
3.10.5.1.
KONVENTIONELLE
METHODE
59
3.10.5.2.
NACHWEIS
MIT
BIOTINYLIERTEN
ANTIKOERPERN
59
3.11.
EXPERIMENTE
ZUM
NACHWEIS
VON
PROTEIN-INTERAKTIONEN
60
3.11.1.
DAS
YEAST
TWO
HYBRID-SYSTEM
60
3.11.1.1.
DIE
VEKTOREN
PAS2-L
UND
PACT2
61
3.11.1.2.
REZIPIENTENSTAMM
61
3.11.1.3.
EXPRESSIONSNACHWEIS
DER
FUSIONSPROTEINE
62
3.11.1.4.
0-GALAKTOSIDASE
TEST
FUERS.
CEREVISIAE
62
3.11.1.5.
3-AMINOTRIAZOL-SELEKTION
62
3.1
1.2.
IN-VITRO
PHOSPHORYLIERUNGSTESTS
63
3.12.
PHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
63
3.12.1.
SCHWAERMPLATTEN
63
3.12.2.
KAPILLARTEST
63
3.12.3.
SCHWIMMGESCHWINDIGKEITSBESTIMMUNG
64
3.12.4.SS-GALAKTOSIDASE
TEST
FUER
E.COLI
UND
S.MELILOTI
64
4.
ERGEBNISSE
66
4.1.
IN-VIVO
UND
IN-VITRO
ANALYSE
NEUER
CHEMOTAXISKOMPONENTEN
66
4.1.1.
KONSTRUKTION
VON
DELETIONSMUTANTEN
66
4.1.1.1.
SOUTHERN
BLOT
ANALYSEN
DER
TSORFL
(ETLPA)-,TSORF2
UND
BDTLPA
ORF2}-LAUT2ITY.CTL
68
4.1.1.2.
SOUTHERN
BLOT
ANALYSEN
DER
ISCHEW
UND
ECHED
MUTANTEN
72
4.1.1.3.
SOUTHERN
MOT-ANALYSE
BDTLPA
CHED)
UND
BDPRF2
CHEYL)
MUTANTEN
73
4.1.2.
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
DELETIONSMUTANTEN
75
4.I.2.I.
TEST
DER
DELETIONSMUTANTEN
AUF
SCHWAERMPLATTEN
75
4.I.2.2.
BESTIMMUNG
DER
SCHWIMMGESCHWINDIGKEIT
UND
ANALYSE
DER
SCHWIMM-MUSTER
VON
FREISCHWIMMENDEN
ZELLEN
76
4.1.2.3.
KAPILLARTESTS
MIT
PROLIN
ALS
LOCKSTOFF
83
4.1.3.
EINFLUSS
VON
TLPA
AUF
DAS
SCHWAERMVERHALTEN
VON
E.
COLI
85
4.1.4.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE:
TLPA,
ORF2,
CHEW
UND
CHED
89
4.1.4.1.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
ORF2
90
4.I.4.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
CHEW
91
4.1.4.3.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
TLPA
92
4.1.4.4.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
CHED
94
4.1.5.
FUNKTIONSTESTS
MIT
DEN
KOMPONENTEN
TLPA,
ORF2
UND
CHEW
95
4.1.5.1.
INTERAKTIONEN
IM
YEAST
TWO
HYBRID-SYSTEM
95
4.1.5.2.
EINFLUSS
VON
TLPA,
ORF2
UND
CHEW
AUF
DIE
ATP-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CHEA
97
4.2.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUG
VON
MCP
GENEN
102
4.2.1.
BESTIMMUNG
DER
ZAHL
AN
MCPS
BEI
S.
MELILOTI
102
4.2.2.
IDENTIFIZIERUNG
WEITERE
MCP
GENE
ANHAND
IHRER
SIGNALDOMAENEN
104
4.2.3.
AEHNLICHKEITEN
ZWISCHEN
DEN
ABGELEITETEN
SIGNALDOMAENEN
DER
SIEBEN
MCP
GENE
UND
TLPA
108
4.2.4.
ISOLIERUNG
DER
MCP
GENE
VON
S.
MELILOTI
109
4.2.4.1.
ISOLIERUNG
VON
MCP
GENLOCI
AUS
EINER
X-ZAP
DNA-BANK
109
4.2.4.2.
ISOLIERUNG
VON
MCP
GENEN
VON
S.
MELILOTI
MITTELS
PLASMID-RESCUE
111
4.2.5.
KARTIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
ISOLIERTEN
MCP
GENLOCI
4.2.5.1.
DAS
MCPU
GEN
113
113
4.2.5.2.
DASMCPIFGEN
119
4.2.5.3.
DASMEPAGEN
124
4.2.5.4.
DAS
MCPY
GEN
130
4.2.5.5.
DAS
MCPZ
GEN
136
4.2.6.
COMPUTERGESTUETZTE
STRUKTURANALYSE
DER
ISOLIERTEN
MCPS
142
4.2.7.
LESERASTER
IN
DER
UMGEBUNG
DER
ISOLIERTEN
MCP
GENE
144
4.3.
IDENTIFIZIERUNG
VON
TRANSKRIPTIONSEINHEITEN
DES
FLAGELLAR
REGULON
UND
DIE
ABHAENIGKEIT DER EXPRESSION
VON
DEFINIERTEN
GENPRODUKTEN
BEI
5.
MELILOTI
150
4.3.1.
LOKALISIERUNG
VON
PROMOTOREN
MITTELS
ZACZ-TRANSLATIONSFUSIONEN
150
4.3.1.1.
IDENTIFIZIERUNG
UND
KNOCK-OUT
DES
SS
GALAKTOSIDASE
GENS
(LACZ)
VON
S.
MELILOTI
150
4.3.1.2.
IDENTIFIZIERUNG
UND
EINGRENZUNG
DES
TLPA.
PROMOTORS
MITTELS
DELETIONSANALYSE
VON
ZACZ-TRANSLATIONSFUSIONEN
153
4.3.1.3.
LOKALISIERUNG
ZWOELF
WEITERE
PROMOTOREN
MITTELS
ZACZ-FUSIONEN
155
4.3.1.4.
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
RELATIVEN
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
VON
14
IDENTIFIZIERTEN
PROMOTOREN
MITTELS
SS-GALAKTOSIDASE
TEST
158
4.3.2.
BESTIMMUNG
DER
TRANSLATIONSSTARTS
DER
GENE
TLPA,FLIF,
MOTA
UND
OR/20
161
4.3.3.
BESTIMMUNG
DER
TRANSKRIPTIONSSTARTS
VON
ACHT
TRANSKRIPTIONSEINHEITEN
DES
FLAGELLAR
REGULON
MITTELS
5
'
RACE
162
4.3.4.
REGULATION
DES
FLAGELLAR
REGULONS
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DEFINIERTEN
GENPRODUKTEN
164
4.3.4.1.
VISNUNDVISR
164
4.3.4.2.
FLAGELLINE,
CHEMOTAXISKOMPONENTEN
UND
FLIF
167
4.3.4.3.
MOTA,
FLIM
UND
FLIN
170
4.3.4.4.
ORFL4
UND
ORF20
172
4.3.4.5.
ORFLO,
ORF23
UND
ORF30
175
4.3.4.6.
ORF3
8
UND
DIE
MOTORKOMPONENTEN
MOTBC
177
5.
DISKUSSION
ISI
5.1.
TLPA
UND
ORF2
181
5.2.
CHEMOREZEPTOREN
187
5.3.
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
DES
FLAGELLAR
REGULON
191
6.
ZUSAMMENFASSUNG
196
7.
LITERATURVERZEICHNIS
199 |
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