Untersuchungen zu den genetischen Ursachen hereditärer Netzhautdegenerationen des Menschen: die Positionsklonierung als Strategie zur Isolierung und Charakterisierung retinaler Gene
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2001
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INHALTSVERZEICHNIS
L
INHALTSVERZEICHNIS
I. ZUSAMMENFASSUNG 6
SUMMARY 8
II. EINLEITUNG 10
1. AUFBAU UND FUNKTION DES MENSCHLICHEN AUGES UND DER NETZHAUT.10
2. DIE POSITIONSKLONIERUNG ALS STRATEGIE ZUR ISOLIERUNG VON
KRANKHEITSGENEN.13
3. ERKRANKUNGEN DER NETZHAUT. 16
3.1 HEREDITAERE NETZHAUTERKRANKUNGEN. 16
3.1.1 GENERALISIERTE NETZHAUT-ADERHAUTDEGENERATIONEN MIT PERIPHEREM
BEGINNL6
3.1.2 GENERALISIERTE NETZHAUT-ADERHAUTDEGENERATIONEN MIT ZENTRALEM
BEGINN.L9
3.1.3 MAKULADEGENERATIONEN.19
3.2 ALTERSBEDINGTE MAKULADEGENERATION.27
4. ZIELSETZUNGEN.31
III. METHODEN 32
1. PATIENTEN UND KLINISCHE DATEN.32
2. PRAEPARATION VON DNA.34
2.1 ISOLIERUNG HUMANER GENOMISCHER DNA AUS VOLLBLUT.34
2.1.1 SALZEXTRAKTION.35
2.1.2 PHENOLEXTRAKTION UND ETHANOLFAELLUNG.35
2.2 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS GEWEBE.35
2.3 PRAEPARATION REKOMBINANTER DNA.36
2.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID/COSMID-DNA AUS E.
COLI. 36
2.3.1.1 ANALYTISCHE PLASMID-ISOLIERUNG.36
2.3.1.2 HALBPRAEPARATIVE PLASMID-ISOLIERUNG.37
2.3.2 HALBPRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON PL/PAC-DNA.37
2.3.3 HALBPRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON X-PHAGEN-DNA.38
2.3.3.1 HERSTELLUNG VON PHAGENLYSATEN.38
2.3.3.2 LAMBDA-DNA ISOLIERUNG.38
2.3.4 PRAEPARATION VON DNA AUS HEFEZELLEN.39
2.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.40
3. PRAEPARATION VON GESAMT-RNA.40
3.1 ISOLIERUNG AUS GEWEBE.40
3.1.1 HOMOGENISIERUNG.41
3.1.2 EXTRAKTION.41
3.2 ISOLIERUNG AUS PERIPHEREN BLUTLYMPHOZYTEN.41
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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_INHALTSVERZEICHNIS 2
3.3 ISOLIERUNG AUS ZELLKULTUREN.42
3.3.1 KULTIVIERUNG VON LYMPHOBLASTOIDEN ZELLLINIEN.42
3.3.1.1 ISOLIERUNG VON LYMPHOZYTEN MITTELS
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION.42
3.3.1.2 TRANSFORMATION MIT EPSTEIN-BARR-VIREN (EBV).42
3.3.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN.4.43
3.3.3 RNA-ISOLIERUNG.43
3.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA.43
4. GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG UND ISOLIERUNG VON
DNA-FRAGMENTEN.43
4.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.43
4.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.44
4.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.45
4.3.1 NIEDRIG SCHMELZENDE AGAROSE.45
4.3.2 ELEKTROELUTION.45
4.3.3 KIESELSAEURE-GELE.46
5. HERSTELLUNG REKOMBINANTER DNA.;.46
5.1 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.46
5.2 KLONIERUNG VON RESTRIKTIONSVERDAUTEN DNA FRAGMENTEN.:.47
5.2.1 PRAEPARATION DER VEKTOR-DNA.47
5.2.2 DEPHOSPHORILIERUNG DES VEKTORS.47
5.2.3 LIGATION.47
5.3 TRANSFORMATION VON BAKTERIENZELLEN.48
5.3.1 CHEMISCHE TRANSFORMATION.48
5.3.1.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN.48
5.3.1.2 TRANSFORMATION VON E. COLI DH5A.48
5.3.2 ELEKTROPORATION.49
5.3.2.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN.49
5.3.22
TRANSFORMATION. 49
6. NACHWEIS SPEZIFISCHER NUKLEINSAEURE-FRAGMENTE.50
6.1 TRANSFER AUF NYLONMEMBRANEN.50
6.1.1 SOUTHEM-BLOT.50
6.1.2 DOT-BLOT.51
6.1.3 KOLONIEHYBRIDISIERUNG.51
6.1.4 NORTHERN BLOT.52
J
6.1.4.1 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA IN AGAROESE-GELEN.52
6.1.4.2 VAKUUM-TRANSFER AUF NYLONMEMBRANEN.52
6.2 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA.53
6.2.1 MARKIERUNG DURCH RANDOM-PRIMING.53
6.2.2 5-ENDMARKIERUNG. 53
6.2.3 REINIGUNG DER SONDEN.54
6.3 HYBRIDISIERUNG.54
6.3.1. VORBEREITUNG UND HYBRIDISIERUNG DER NYLONMEMBRAN.54
6.3.2 WASCHEN DER MEMBRAN UND AUTORADIOGRAPHIE.55
6.3.3 ENTFERNEN DER HYBRIDISIERUNGSSONDE.55
7. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).55
7.1 STANDARD-PCR-REAKTION.56
7.2 PCR-AMPLIFIKATION LANGER DNA-FRAGMENTE.57
7.3 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN.57
INHALTSVERZEICHNIS 3
7.3.1 KLONIERUNG MIT DEM TA CLONING KIT.57
7.3.2 KLONIERUNG MIT DEM PCR-SCRIPT
YY
AMP SK (+) KIT.58
7.4 ANWENDUNGEN DER PCR.58
7.4.1 CHARAKTERISIERUNG POLYMORPHER MIKROSATELLITEN: KOPPLUNGSANALYSE.58
7.4.1.1 BERECHNUNG VON
LOD SCORES.59
7.4.1.2 WAHRSCHEINLICHKEITSBERECHNUNG FUER HAPLOTYPE SHARING.60
7.4.2 ANALYSE VON EINZELSTRANG-KONFORMATIONSPOLYMORPHISMEN (SSCP).61
7.4.3 ISOLIERUNG VON SEQUENZFRAGMENTEN DURCH INTER-ALU-PCR.61
7.4.4 ISOLIERUNG VON YAC-ENDFRAGMENTEN DURCH LIGATIONSVERMITTELTE PCR.62
7.4.4:1 RESTRIKTIONSVERDAU DER HEFE-DNA.62
7.4.4.2 LIGATION VON DOPPELSTRAENGIGEN LINKER-MOLEKUELEN.62
7.4.4.3 PCR-AMPLIFIKATION DER INSERTIONSENDEN.63
7.4.5 ISOLIERUNG VON PAC-ENDFRAGMENTEN DURCH DOP-VEKTOR PCR.63
7.4.6 REVERSE TRANSKRIPTASE (RT)-PCR.64
7.4.6.1 SYNTHESE DES CDNA-ERSTSTRANGES.64
7.4.6.2 NACHWEIS INTAKTER CDNA.65
7.4.5 SCHNELLE VERVIELFAELTIGUNG VON CDNA-ENDEN (RACE-PCR^.65
7.4.5.1 5-RACE-PCR. 66
7.4.5.2 3-RACE-PCR.66
8. DNA SEQUENZANALYSE.66
8.1 SEQUENZANALYSE MIT [A-S]-DATP. 67
8.2 ZYKLISCHE SEQUENZIERUNG MIT [A-^PJ-DDNTPS.67
8.3 SEQUENZIERUNG VON PCR-PRODUKTEN.68
8.4 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA.68
9. IDENTIFIKATION SPEZIFISCHER DNA-FRAGMENTE AUS DNA-BANKEN.68
9.1 AUSPLATTIEREN EINER RETINALEN X-PHAGEN-CDNA-BANK.68
9.2 CEPHYAC-BANK.69
9.3 RPQ-HUMANE PAC-BANK.69
9.4 LLNLP HUMANE CHROMOSOM 2 SPEZIFISCHE PAC-BANK.70
10. RNA
IN SZFU-HYBRIDISIERUNG AN PARAFFINSCHNITTEN.70
10.1 HERSTELLUNG VON GEWEBESCHNITTEN.70
10.2 HERSTELLUNG UND MARKIERUNG DER RNA-SONDE.71
10.2.1 LINEARISIERUNG DER PLASMID-DNA.71
10.2.2MARKIERUNG DER RNA-SONDE DURCH
IN UZ'FRO-TRANSKRIPTION.,.71
10.3 HYBRIDISIERUNG.72
10.4 HISTOLOGISCHE DOPPELFAERBUNG MIT HAEMALAUN UND EOSIN.73
11. DAS HEFE ZWEI-HYBRID SYSTEM.73
11.1 HERSTELLUNG SPEZIFISCHER FUSIONSKLONE. 75
11.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER HEFEN.75
11.3 TRANSFORMATION.76
11.4 NACHWEIS VON PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN.76
12. COMPUTERGESTUETZTE ANALYSE VON SEQUENZDATEN.76
12.1 LOKALE SOFTWARE. 76
12.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE RESSOURCEN IM
WORLD WIDE WEB.77
12.2.1 DATENBANKEN.77
12.2.2 SEQUENZVERGLEICHE DURCH BLAST-ALGORITHMEN.78
12.3 BERECHNUNG DES SPLICE SITE DISCRIMINATION SCORE ZUR IDENTIFIKATION
VON SPLEISSSTELLEN79
. INHALTSVERZEICHNIS 4
IV. ERGEBNISSE 81
1. KOPPLUNGSANALYSE BEI DER NORTH CAROLINA MAKULADYSTROPHIE.81
1.1 GENOTYPISIERUNG. 81
1.2 ZWEI-PUNKT KOPPLUNGSANALYSE.82
1.3 VERFEINERUNG DER MINIMALEN KANDIDATENREGION.82
1.4 ANALYSE EINES GEMEINSAMEN KRANKHEITSASSOZIIERTEN HAPLOTYPEN.85
2. ANALYSE DER KANDIDATENGENREGION FUER DIE X-GEBUNDENE RETINOSCHISIS AUF
XP22.2.87
2.1 ERSTELLUNG EINES PAC-CONTIGS.87
2.2 ANALYSE DES KANDIDATENGENS TU12.88
2.2.1 ISOLIERUNG UND KLONIERUNG DER TU12-CDNA.88
2.2.2 EXPRESSIONSANALYSE.90
2.2.3 GENOMISCHE ORGANISATION.91
2.2.4 ANALYSE DER VORHERGESAGTEN PROTEINSEQUENZ.92
2.2.5 MUTATIONSANALYSE IN RETINOSCHISIS PATIENTEN.94
2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION DES RSL-GEM IN DER RETINA.96
2.3.1 KLONIERUNG DES ORTHOLOGEN MAUSGENS
RSLH.96
2.3.2 ANALYSE DER RAEUMLICHEN EXPRESSION VON RSLH.96
2.3.2.1 RNA IN SIFU-HYBRIDISIERUNG AN PARAFFINSCHNITTEN.96
232.2 RT-PCR VON RSLH IN VERSCHIEDENEN MAUSLINIEN.97
2.3.3 ANALYSE DER ZEITLICHEN EXPRESSION VON RSLH.99
3. ANALYSE DER KANDIDATENGENREGION FUER RADIAERE DRUSEN AUF 2PL6-21.101
3.1 ERSTELLUNG EINES YAC-, PAC-CONFIGS.101
3.2 UNTERSUCHUNG DES KANDIDATENGENS PNEU60.102
3.2.1 ISOLIERUNG UND KLONIERUNG DER VOLLSTAENDIGEN CDNA-SEQUENZ.102
3.2.2 EXPRESSIONSANALYSE.104
3.2.3 GENOMISCHE ORGANISATION.105
3.2.4 FISH-KARTIERUNG VON PNEUSSO.106
3.2.5 ANALYSE DER VORHERGESAGTEN PROTEINSEQUENZ.107
3.2.6 MUTATIONSANALYSE IN PATIENTEN MIT RADIAEREN DRUSEN.108
3.2.7 MUTATIONSANALYSE IN AMD PATIENTEN.108
3.2.8 ANALYSE DER RAEUMLICHEN EXPRESSION VON PNEUSSO.111
3.3 UNTERSUCHUNG VON EFEMP1.111
3.3.1 GENOMISCHE STRUKTUR VON
EFEMP1.112
3.3.2 ANALYSE DER R345W MUTATION IN DHRD/MLVT-FAMILIEN.113
3.3.3 MUTATIONSANALYSE IN PATIENTEN MIT SPORADISCHEN RADIAEREN DRUSEN.114
3.3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON EFEMP1.115
3.3.4.1 KLONIERUNG DES ORTHOLOGEN
EFEMPL-GENS VOM RIND.116
3.3.4.2 ANALYSE ZUR INTERAKTION VON EFEMP1 MIT ANDEREN PROTEINEN.118
4. UNTERSUCHUNGEN ZUR RAEUMLICHEN EXPRESSION VON
CACNA1F IN DER RETINA.121
4.1 RNA-IN SIFW-HYBRIDISIERUNG VON CACNA1F AN PARAFFINSCHNITTEN.121
4.2 ANALYSE DES RAEUMLICHEN EXPRESSIONSPROFILS DES CACNAIF-GENS DER
MAUS.122
4.2.1 RT-PCR VON JM8 IN VERSCHIEDENEN MAUSLINIEN.122
4.2.2 RNA
IN SITU-HYBRIDISIERUNG VON JM8 AN PARAFFINSCHNITTEN.123
INHALTSVERZEICHNIS 5
V. DISKUSSION 124
VI. LITERATUR 142
VII. PUBLIKATIONEN 160
1. BEGUTACHTETE BZW. EINGEREICHTE VEROEFFENTLICHUNGEN.160
2. KONGRESSBEITRAEGE.161
VIII. ANHANG 163
A. CHEMIKALIEN UND ENZYME.163
B. SYNTHETISCHE NUKLEINSAEUREN UND NUKLEOTIDE. 163
C. GERAETE. 165
D. VERBRAUCHSMATERIALIEN.166
E. MAUSLINIEN. 167
F. HEFESTAMM.168
G. BAKTERIENSTAEMME.168
H. MEDIEN.168
I. ANTIBIOTIKA.170
J. PCR-BEDINGUNGEN.171
K. VERWENDETE ABKUERZUNGEN.175
L. GENETISCHER CODE.178
M. BEZEICHNUNG DEGENERIERTER OLIGONUKLEOTIDE. 178 |
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