Charakterisierung der molekularen Grundlagen für die Speziesspezifität der DNA-Replikation von Polyomaviren:
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2000
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| Beschreibung: | Jena, Univ., Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
1.1 DNA-REPLIKATION VON PAPOVAVIREN.1
1.1.1 VIRALE BESTANDTEILE DES REPLIKATIONSSYSTEMS.2
1.1.2 ZELLULAERE REPLIKATIONSPROTEINE.3
1.1.3 MECHANISMUS DER VIRALEN, ZELLFREIEN DNA-REPLIKATION.!.7
1.1.4 SPEZIESSPEZIFITAET DER ZELLFREIEN DNA-REPLIKATION.8
1.2 ZELLULAERE DNA-REPLIKATION. 9
1.3 KONTROLLE DER ZELLULAEREN DNA-REPLIKATION IM ZELLZYKLUS.10
1.3.1 ZELLZYKLUS.10
1.3.2 CYCLINE UND CYCLINABHAENGIGE KINASEN.11
1.4 AUFGABENSTELLUNG.13
2 MATERIALIEN UND GERAETE.15
2.1 ZELLINIEN. 15
2.1.1 SAEUGERZEILINIEN.15
2.1.2 INSEKTENZELLINIE.15
2.2 BAKTERIENSTAEMME.15
2.3 BACULOVIREN.15
2.4 PLASMIDE.15
2.5 ANTIKOERPER.16
2.6 OLIGONUKLEOTIDE.16
2.7 DNA UND DNA-LAENGENSTANDARDS.17
2.8 MOLEKULARGEWICHTSMARKER.17
/
2.9 ENZYME.17
2.10 SAEULENMATERIALIEN.18
2.11 KOMMERZIELL ERHAELTLICHE REAGENZIENGEMISCHE (KITS).18
2.12 GERAETE.18
2.13 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL.19
2.14 MEDIEN.20
2.15 PUFFER.20
2.16 COMPUTERPROGRAMME ZUR STRUKTURPROGNOSE.20
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/960873678
INHALTSVERZEICHNIS
TT
3 METHODEN.21
3.1 ARBEITEN MIT DNA.21
3.1.1 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR).21
3.1.1.1 PCR NACH DER METHODE DER "OVERLAP EXTENSION".21
3.1.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA.22
3.1.2.1 SCHNELLPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.22
3.1.2.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA UEBER IONENAUSTAUSCHER-SAEULEN.23
3.1.2.3 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA UEBER
CSCL-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.23
3.1.3 ANALYSE VON DNA.24
3.1.3.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.24
3.1.3.2 NEUTRALE AGAROSEGELELEKTROPHORESE.24
3.1.3.3 ISOLIERUNG VON DNA AUS PRAEPARATIVEN AGAROSEGELEN.25
3.1.4 MODIFIKATION VON DNA.YY.TTT.25
3.1.4.1 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA.25
3.1.4.2 5'-ENDMARKIERUNG VON DNA.25
3.1.4.3 AUFFULLEN VON 5'-UEBERHAENGENDEN ENDEN.26
3.1.4.4 DEPHOSPHORYLIERUNG MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE.26
3.1.4.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.26
3.1.5 SEQUENZIERUNG VON DNA.26
3.2 METHODEN ZUR ANALYSE VON PROTEINEN.27
3.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG MIT COOMASSIE BRILLIANT BLUE.27
3.2.2 DETEKTION VON PROTEINEN DURCFY POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE).27
3.2.2.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).27
32.2.2
PROTEINFARBUNG IN SDS-GELEN.28
3.2.2.3 WESTERN-BLOT.28
3.3 ARBEITEN MIT BAKTERIEN. 29
3.3.1 VERMEHRUNG VON BAKTERIEN IN FLUESSIGKULTUR.29
3.3.2 BESTIMMUNG DER OPTISCHEN DICHTE VON FLUESSIGKULTUREN.29
3.3.3 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN NACH DER CACL
2-METHODE.29
3.3.4 HERSTELLUNG ELEKTROTRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN.30
3.3.5 TRANSFORMATION VON
E. COLI.30
3.3.6 ELEKTROTRANSFORMATION VON
E. COLI.31
3.4 ZELLKULTUR.
3.4.1 KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN.
31
INHALTSVERZEICHNIS III
3.4.2 KULTIVIERUNG VON INSEKTENZELLEN.32
3.4.3 EINFRIEREN, LAGERUNG UND AUFTAUEN VON ZELLEN.32
3.5 DAS BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM.33
3.5.1 HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN BACULOVIREN.33
3.5.2 AMPLIFIKATION VON REKOMBINANTEN VIREN.33
3.5.3 IDENTIFIKATION VON REKOMBINANTEN VIREN.34
3.5.4 LAGERUNG VON REKOMBINANTEN VIREN.*.34
3.5.5 EXPRESSION VON PROTEINEN IM BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM.34
3.5.6 HERSTELLUNG VON ROHEXTRAKTEN.34
3.6 AUFREINIGUNG VON PROTEINEN.35
3.6.1 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPERSAEULEN.35
3.6.1.1 REINIGUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER.35
3.6.1.2 KOPPLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN AN CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE.36
3.6.1.3 KOPPLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN AN PROTEIN A-AGAROSE.37
3.6.2 REINIGUNG REKOMBINANTER KOMPLEXE DER DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE AUS
INSEKTENZELLEN.37
3.6.3 AUFREINIGUNG VON T-ANTIGEN AUS INSEKTENZELLEN.39
3.6.3.1 IMMUNREINIGUNG VON POLYOMAVIRUS-T-ANTIGEN.39
3.6.3.2 IMMUNAUFREINIGUNG VON SV40-T-ANTIGEN.41
3.7 HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN AUS SAEUGERZELLEN. 42
3.8 AKTIVITAETSTESTS.42
3.8.1 DNA-POLYMERASE-AKTIVITAETSTEST.42
3.8.2 PRIMASE-AKTIVITAETSTEST.43
3.9 DNA-SYNTHESE AUF ( X174-SSDNA.44
3.10 INITIATIONSREAKTIONEN VON DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE-KOMPLEXEN IN
VITRO.45
3.10.1 POLYOMAVIRUS-INITIATION IN VITRO.
L.45
3.10.2 SV40-INITIATIONEN IN VITRO.47
3.10.3 ANALYSE DER INITIATIONSPRODUKTE DURCH DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-
GELELEKTROPHORESE .47
3.11 DNA-REPLIKATION IN VITRO.47
3.11.1 ZELLFREIE POLYOMAVIRUS-DNA-REPLIKATION.48
3.11.2 ZELLFREIE SV40-DNA-REPLIKATION.50
3.12 PHOSPHORYLIERUNG VON DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE IN VITRO.50
INHALTSVERZEICHNIS TV
4 ERGEBNISSE. 52
4.1 KLONIERUNG DER CDNA VON MAUS/HUMAN-HYBRIDEN DER P48-UNTEREINHEIT VON
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE.52
4.2 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEN KOMPLEXEN DER DNA-
POLYMERASE-A-PRIMASE.
59
4.2.1 EXPRESSION DER P48-HYBRIDGENE.*.
59
4.2.2 REINIGUNG VON REKOMBINANTEN KOMPLEXEN DER DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
DURCH
MONOKLONALE ANTIKOERPERSAEULEN.60
4.2.2
.1
AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEN MURINEN UND HUMANEN DNA-POLYMERASE-A-
PRIMASE-KOMPLEXEN.60
4.2.2.2 AUFFEINIGUNG VON REKOMBINANTEN HYBRIDEN KOMPLEXEN DER
DNA-POLYMERASE-A-
PRIMASE. 61
4.3 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN AN REKOMBINANTEN KOMPLEXEN DER DNA-
POLYMERASE-A-PRIMASE.63
4.3.1 DNA-SYNTHESE AUF EINZELSTRANG-DNA.63
4.4 ZELLFREIE DNA-REPLIKATION DURCH REKOMBINANTE KOMPLEXE DER
DNA-POLYMERASE-
A-PRIMASE.64
4.4.1 POLYOMAVIRUS-DNA-REPLIKATION.65
4.4.2 ZELLFREIE REPLIKATIONEN VON SV40-DNA.71
4.5 INITIATIONEN DER DNA-REPLIKATION DURCH REKOMBINANTE KOMPLEXE DER
DNA-
1
POLYMERASE-A-PRIMASE.72
4.5.1 INITIATIONSREAKTIONEN DER POLYOMAVIRUS-DNA-REPLIKATION.73
4.5.2 INITIATIONEN DER SV40-DNA-REPLIKATION.76
4.6 PHOSPHORYLIERUNG DER UNTEREINHEITEN DES DNA-POIYMERASE-A-PRIPIASE-
KOMPLEXES.77
5 DISKUSSION. 80
5.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION DER HYBRIDEN P48-PRIMASE-UNTEREINHEIT.80
5.2 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE-
KOMPLEXEN.
81
5.3 SPEZIESSPEZIFITAET DER DNA-REPLIKATION.82
5.3.1 ZELLFREIE POLYOMAVIRUS-DNA-REPLIKATION.82
INHALTSVERZEICHNIS V
5.3.2 INITIATION DER POLYOMAVIRUS-DNA-REPLIKATION.85
5.3.3 STRUKTURELLE VORHERSAGEN FUER BEREICHE DER P48-UNTEREINHEIT UND
ANALYSE VON
PUNKTMUTANTEN DER P48-UNTEREINHEIT IN DER PYV-DNA-REPLIKATION.87
5.3.4 POLYOMAVIRUS-DNA-REPLIKATION DER PUNKTMUTANTEN.89
5.3.5 ZELLFREIE SV40-DNA-REPLIKATION.91
5.4 PHOSPHORYLIERUNG DER DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE DURCH
ZELLZYKLUSABHAENGIG
REGULIERTE KINASEN.*.
93
5.5 MODELLE ZUR KONTROLLE DER SPEZIESSPEZIFITAET.
94
6 ZUSAMMENFASSUNG. 97
7 LITERATURVERZEICHNIS. 98
8 ANHANG.111 |
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