Ceramidsynthese in Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 2001 |
| Beschreibung: | 149 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS:
1. ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 6 / 8
2. EINLEITUNG 10
2.1. BIOSYNTHESE VON SPHINGOLIPIDEN.11
2.2. ABBAU VON SPHINGOLIPIDEN.17
2.3. FUNKTION VON SPHINGOLIPIDEN.19
2.3.1. SPHINGOLIPIDE IM MEMBRANAUFBAU.19
2.3.2. TRANSPORT GPI-VERANKERTER PROTEINE.20
2.3.3. DIE ROLLE VON CERAMID IN DER SIGNALTRANSDUKTION.23
2.3.4. WEITERE FUNKTIONEN VON SPHINGOLIPIDEN.27
2.4. VORARBEITEN UND ZIELSETZUNG.29
3
ERGEBNISSE 31
3.1. ALLGEMEINE CHARAKTERISIERUNG VON LAGLP UND DGTLP.31
3.1.1. LAGLP UND DGTLP SIND KONSERVIERT IN HOEHEREN EUKARYONTEN.31
3.1.2. DER N-TERMINUS VON DGTLP IST CYTOSOLISCH ORIENTIERT.37
3.1.3. DER C-TERMINUS UND NICHT DER N-TERMINUS VON DGTLP IST FUNKTIONELL
BEDEUTSAM.41
3.1.4. DGT 1 P RESIDIERT AUSSCHLIESSLICH IN DER ER-MEMBRAN.43
3.1.5. LAGLP UND DGTLP INTERAGIEREN IN DER ER-MEMBRAN.'.46
3.2. DIE FUNKTION VON LAGLP UND DGTLP IN DER BIOSYNTHESE VON
SPHINGOLIPIDEN.51
3.2.1. DIE SYNTHESERATE INOSITOLHALTIGER SPHINGOLIPIDE IST DRASTISCH
REDUZIERT IN
ABWESENHEIT VON LAG1 UND DGT1.51
3.2.2.
LAG 1 ADGTL A-ZE\LEN BESITZEN REDUZIERTE MENGEN INOSITOLHALTIGER
SPHINGOLIPIDE.54
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3. IPCERS-AKTIVITAET IST IN
LAGLADGTLA VORHANDEN.55
3.2.4. DIE ABWESENHEIT VON
LAG1 UND DGT1 FUHRT ZU EINER AKKUMULATION
VON SPHINGOIDBASEN.57
3.2.5. LAGLP UND DGTLP SIND ESSENTIELL FUER DEN EINBAU VON EXOGENEN
DIHYDROSPHINGOSIN IN CERAMID IN VIVO.60
3.2.6.
LAGLADGTL A-ZELLEN SIND RESISTENT GEGENUEBER FUMONISIN BL.63
3.2.7. DIE FETTSAEUREELONGATION IST NICHT REDUZIERT IN
LAGLADGTLA.65
3.2.8. UEBEREXPRESSION VON
LAGL UND DGT1 BEEINFLUSST NICHT DIE
CERAMIDSYNTHESE IN VIVO.67
3.2.9. LAGLP UND DGTLP SIND EIN ESSENTIELLER BESTANDTEIL DER
CERS-REAKTION IN
VITRO.69
3.3. DIE FUNKTION VON YPCLP UND YDCLP ALS SUPPRESSOREN DER
LAGLADGTL A-
DOPPELDELETION.72
3.3.1. UEBEREXPRESSION VON
YPC1 UND YDCL ERHOEHT DIE SYNTHESERATE
KOMPLEXER SPHINGOLIPIDE IN
LAGLADGTLA.73
3.3.2.
YPC1- UND TDCI-SUPPRIMIERTE LAGLADGTL A-ZELLEN BESITZEN ERHOEHTE
MENGEN KOMPLEXER SPHINGOLIPIDE.75
3.3.3. DER EINBAU VON EXOGENEM DHS IN CERAMID IST UNABHAENGIG VON YPC 1 P
UND YDCLP.77
3.3.4. DIE ZUSAETZLICHE DELETION VON
YPC1 UND YDCL IN LAGLADGTL A-ZELLEN
INHIBIERT DIE SPHINGOLIPIDSYNTHESE KOMPLETT.78
3.3.5. CERAMID IST FUER DAS UEBERLEBEN DER ZELLEN BEI ERHOEHTEN
TEMPERATUREN
ODER NACH HITZESCHOCK ESSENTIELL.80
4. DISKUSSION 83
4.1. LAGLP UND DGTLP: ESSENTIELLE BESTANDTEILE DER CERS.83
4.2. MOEGLICHE FUNKTIONEN FUER LAGLP UND DGTLP.85
4.2.1. SIND LAGLP UND DGTLP KATALYTISCH AKTIV?.85
4.2.2. REGULIEREN LAGLP UND DGTLP DIE CERS-AKTIVITAET?.85
4.2.3. WIRKEN LAGLP UND DGTLP SUBSTRATAKTIVIEREND?.86
2
INHALTSVERZEICHNIS
4.3. CERAMID UND DER TRANSPORT GPI-VERANKERTER PROTEINE.88
4.4. CERAMID UND HITZESTRESS.90
4.5. IST CERAMID ESSENTIELL ?.93
5. MATERIAL UND METHODEN 96
5.1. MATERIAL.96
5.1.1. CHEMIKALIEN UND ENZYME.96
5.1.2. RADIOISOTOPE.96
5.1.3. PUFFER.96
5.1.4. KULTIVIERUNGSMEDIEN.^.98
5.1.5. VERWENDETE STAEMME.100
5.1.6. VERWENDETE PLASMIDE.101
5.1.7. VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE.102
5.1.8. VERWENDETE ANTIKOERPER.102
5.2. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.103
5.2.1. KULTIVIERUNG UND ANZUCHT VON
S. CEREVISIAE.103
5.2.2. TRANSFORMATION VON
S. CEREVISIAE.104
5.2.3. RADIOAKTIVE
IN VI'VO-PULSMARKIERUNG VON S. CEREVISIAE.104
5.2.4. RADIOAKTIVE
IN V/VO-LANGZEITMARKIERUNG VON S. CEREVISIAE.105
5.2.5. STANDARDMETHODEN ZUM ARBEITEN MIT
E. COLI.105
5.3. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.105
5.3.1. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA.105
5.3.2. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.106
5.3.3. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.107
5.3.4. POLYMERASEKETTENREAKTION.107
5.3.5. DNA-SEQUENZIERUNG.108
5.3.6. PLASMIDISOLIERUNG AUS
E. CO//-STAEMMEN.109
5.3.7. KLONIERUNG VON PSTS30 UND DERIVATEN.109
5.3.8. KLONIERUNG VON PRW12, PRW13 UND PRW14.109
3
INHALTSVERZEICHNIS
5
.
4
.
PROTEINCHEMISCHE METHODEN.110
5.4.1. GEWINNUNG VON LYSATEN AUS
S.
CEREVISIAE.110
5.4.2. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION IN LOESUNGEN.111
5.4.3. SDS-PAGE VON PROTEINEN.111
5.4.4. WESTEM-BLOT.112
5.4.5. IMMUNOLOGISCHE DETEKTION MITTELS CHEMOLUMINESZENZ.112
5.4.6. SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN.112
5.4.7. NATIVE IMMUNPRAEZIPITATION SOLUBILISIERTER MEMBRANPROTEINE.113
5
.
5
.
LIPIDANALYTISCHE METHODEN.114
5.5.1. LIPIDEXTRAKTION NACH HANSON UND LESTER (1980).114
5.5.2. LIPIDEXTRAKTION NACH PUOTI
ET AL. (1991).114
5.5.3. LIPIDMODIFIKATION MIT PIPLC.114
5.5.4. MILDE ALKALISCHE HYDROLYSE VON LIPIDEN.115
5.5.5. ENTSALZUNG VON LIPIDEXTRAKTEN.115
5.5.6. LIPOSOMENPRAEPARATION.115
5.5.7. DC VON LIPIDEN.116
5.5.8. VISUALISIERUNG VON LIPIDEN.116
5.5.9. FETTSAEUREANALYTIK.117
5
.
6
.
SUPRAMOLEKULARE ZELLCHEMIE.118
5.6.1. MIKROSOMENPRAEPARATION MIT MECHANISCHER LYSE.118
5.6.2. ER-PRAEPARATION MIT OSMOTISCHER LYSE.119
5.6.3. CYTOSOLPRAEPARATION.120
5.6.4. LIMITIERTE PROTEOLYSE VON DGTLP-HA.121
5.6.5. ANALYSE
IN VZTRO-GENERIERTER COPII-TRANSPORTVESIKEL.121
5.6.6. BESTIMMUNG DER
IN VITRO-AKTIVITAET DER CERS.122
5.6.7. BESTIMMUNG DER
IN V/VO-AKTIVITAET DER IPCERS.122
6. REFERENZEN 124
4
INHALTSVERZEICHNIS
7. ANHANG 145
7.1.
ABKUERZUNGEN.
145
7.2. ABBILDUNGSVERZEICHNIS._ 148
5 |
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