NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR): Untersuchungen zu einem "Schlüsselenzym" der Chlorophyll-Biosynthese in Angiospermen
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DIE
BIOSYNTHESE
VON
CHLOROPHYLL
A
.
3
1.2
DIE
BEDEUTUNG
VON
LICHT
ALS
REGULATIONSFAKTOR
.
7
13
NADPH:PROTOCHLOROPHYLLID-OXIDOREDUKTASE
(POR)
CHARAKTERISIERUNG
DES
YYSCHLUESSELENZYMS
"
IN
ANGIOSPERMEN
.
7
1.4
PROBLEMSTELLUNG
.
9
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
11
2.1
ALLGEMEINES
.
11
2.1.1
CHEMIKALIEN
.
11
2.1.2
GERAETE
.
11
2.1.3
ORGANISMEN
.
12
2.2
PLASTIDENISOLIERUNG
.
13
2.2.1
PFLANZENANZUCHT
.
13
2.2.2
ISOLIERUNG
VON
ETIOPLASTEN
.
13
2.2.3
BESTIMMUNG
DER
ETIOPLASTENKONZENTRATION
.
16
2.2.4
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
ANALYSE
VON
ETIOPLASTEN
(DURCHGEFUEHRT
VON
PROF.
DR.
G.
WANNER)
.
16
23
AUFREINIGUNG
PIGMENTFREIER
POR
AUS
ETIOPLASTEN
.
17
2.3.1
DIFFERENTIELLE
SOLUBILISIERUNG
-
ULTRAZENTRIFUGATIONSSCHRITTE
.
17
2.3.2
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
.
18
2.3.3
PIGMENT-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
19
2.4
UEBEREXPRESSION
DER
POR
IN
E.COLI
UND
PROTEINAUFREINIGUNG
.
20
2.4.1
UEBEREXPRESSIONSBEDINGUNGEN
.
20
2.4.2
PROTEINAUFREINIGUNG
.
21
2.5
PROTEINANALYTIK
.
23
2.5.1
PROTEIN-KONZENTATIONSBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
23
2.5.2
ELEKTROPHORESE
UND
QUALITATIVER
NACHWEIS
DER
POR
.
24
2.5.2.1
SDS-HAMSTOFF-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
24
2.5.2.2
QUALITATIVER
NACHWEIS
DER
POR
.
25
2.5.23
FAERBUNG
DER
POLYACRYLAMIDGELE
.
26
2.S.2.4
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
.
26
INHALTSVERZEICHNIS
2.6
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EXOGENER
PIGMENTE
.
27
2.6.1
HERSTELLUNG
.
27
2.6.2
UV/VIS
UND
MS
DATEN
.
29
2.6.3
BESTIMMUNG
VON
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
.
31
2.6.4
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
FLUORESZENZQUANTENAUSBEUTE
VON
SUBSTRATANALOGEN
PIGMENTEN
DER
POR
IM
VERGLEICH
ZU
PCHLIDE
A
.
31
2.7
ISOLIERUNG
UND
ANALYTIK
VON
LIPIDEN
AUS
ETIOPLASTEN
.
32
2.7.1
EXTRAKTION
DER
LIPIDE
AUS
ETIOPLASTEN
.
32
2.7.2
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
.
32
2.7.3
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE
QUALITATIVE
ANALYSE
.
33
2.7.4
HERSTELLUNG
VON
LIPID-PIGMENT-GEMISCHEN
FUER
ENZYMATISCHE
TESTS
.
33
2.8
ENZYMATISCHE
TESTS
.
34
2.8.1
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
IN
DER
AUFREINIGUNG
DER
POR
AUS
HAFER
.
34
2.8.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
POR
UND
ZUR
KINETIK
DER
REAKTION
.
35
2.8.2.1
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
35
2.8.2.1.1
UV/VIS-SPEKTROSKOPISCHE
ANALYSE
.
35
2.8.2.1.2
HPLC-ANALYSE
.
35
2.8.2.2
HEMMUNG
DER
PHOTOREDUKTION
.
36
2.8.2.2.
1
HEMMUNG
DURCH
SUBSTRATUEBERSCHUSS
-
BESTIMMUNG
DES
SUBSTRATOPTIMUMS
.
36
2.8.2.2.2 BESTIMMUNG
DER
K
M
-
UND
V
MM-WERTE
FUER
PCHLIDE
A
UND
PCHLIDE
B
.
36
2.8.2.2.3
BESTIMMUNG
DES
K
M
-
UND
VMAX-WERTES
FUER
PCHLIDE
A
IN
ANWESENHEIT
VON
CHI
CI
.
36
2.8.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
SPEKTRALEN
VERLAUF
DER
PHOTOREDUKTION
.
37
2.8.3.1
DER
VERLAUF
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
GLYCERINKONZENTRATION
.
37
2.8.3.2 REKONSTITUTIONSVERSUCH
-
UNTERSUCHUNG
DES
LIPIDEINFLUSSES
AUF
DIE
PHOTOUMWANDLUNG
.
38
2.8.3.3
TIEFTEMPERATUR-FLUORESZENZMESSUNGEN
ZUR
ENERGIEUEBERTRAGUNG
ZWISCHEN
ENDOGENEN
PIGMENTEN
IN
80
%
GLYCERIN
.
38
3
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
39
3.1
ISOLIERUNG
PIGMENTFREIER
POR
AUS
PFLANZENMATERIAL
.
39
3.1.1
AUFREINIGUNG
.
39
3.1.1.1
ETIOPLASTEN
ISOLIERUNG
.
39
3.1.1.2
AUFREINIGUNG
DER
POR
DURCH
DIFFERENTIELLE
SOLUBILISIERUNG
UND
ULTRAZENTRIFUGATION
.
41
3.1.1.2.1
ERSTER
ULTRAZENTRIFUGATIONSSCHRITT
.
42
3.1.1.2.2
ZWEITER
ULTRAZENTRIFUGATIONSSCHRITT
.
43
3.1.1.2.3
DRITTER
ULTRAZENTRIFUGATIONSSCHRITT
.
45
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1.3
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
POR
UNTER
ABTRENNUNG
DER
PIGMENTE
.
46
3.1.1.3.1
CHROMATOGRAPHIE
.
46
3.1.1.3.2
VERGLEICH
DER
PIGMENTFREIEN
POR
AUS
HAFER
UND
GERSTE
.
47
3.1.1.3.3
AKTIVITAET
DER
PIGMENTFREI
AUFGEREINIGTEN
POR
.
47
3.1.1.4
VERGLEICH
ZWISCHEN
COOMASSIE-,
SILBER
UND
ANTIKOERPERFAERBUNG
.
48
3.1.2
BESTIMMUNG
DES
MOLAREN
VERHAELTNISSES
VON
ENZYM
ZU
SUBSTRAT
IN
ETIOPLASTEN
.
49
3.1.2.1
PROTEIN
UND
PCHLIDE
A-KONZENTRATIONEN
IN
DEN
FRAKTIONEN
DER
AUFREINIGUNG
.
50
3.1.2.1.1
PROTEINVERTEILUNG
.
50
3.1.2.1.2
PCHLIDE
A
VERTEILUNG
.
51
3.1.2.1.3
VERHAELTNIS
VON
PCHLIDE
A
ZU
PROTEIN
IN
DEN
FRAKTIONEN
DER
AUFREINIGUNG
.
52
3.1.2.2 DENSITOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DES
ANTEILS
AN
POR
IN
DEN
AUFREINIGUNGSFRAKTIONEN
.
53
3.1.2.2.1
RELATIVER
GEHALT
AN
POR
IM
VERHAELTNIS
ZUM
GESAMTPROTEIN
.
53
3.1.2.2.2
ABSOLUTE
MENGEN
AN
POR
(MG)
IM
VERLAUF
DER
AUFREINIGUNG
UND
BERECHNUNG
DER
AUSBEUTE
.
55
3.1.2.2.3 ERGEBNISSE
ZUM
MOLAREN
VERHAELTNIS
ZWISCHEN
SUBSTRAT
UND
ENZYM
.
56
3.1.3
SPEZIFISCHE
AKTIVITAET
DER
POR
IM
VERLAUF
DER
AUFREINIGUNG
.
56
3.1.4
DISKUSSION
.
59
3.2 UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
POR
.
65
3.2.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
VERWENDETEN
PIGMENTE
.
66
3.2.1.1
STRUKTURFORMELN
.
66
3.2.1.2
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
IN
LOESUNGSMITTEL
UND
IN
WAESSRIGEM
MILIEU
.
68
3.2.1.3
RELATIVE
FLUORESZENZQUANTENAUSBEUTE
AUSGEWAEHLTER
PIGMENTE
IM
VERGLEICH
ZU
PCHLIDE
A
.
69
3.2.2
ENZYMTESTBEDINGUNGEN
ZUR
SUBSTRATSPEZIFITAET
UND
ZUR
KINETIK
DER
PHOTOREDUKTION
.
70
3.2.2.1
COFAKTOREN
.
70
3.2.2.2
LICHTSAETTIGUNG
.
70
3.2.2.3
SUBSTRATOPTIMUM
.
71
3.2.3
ENZYMATISCHE
TESTS
ZUR
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
72
3.2.3.1
UV/VIS-SPEKTROSKOPIE
.
72
3.2.3.2
HPLC-UNTERSUCHUNGEN
.
75
3.2.4
KINETIK
DER
PHOTOREDUKTION
.
77
3.2.4.1
BESTIMMUNG
DER
REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT
.
78
3.2.4.2 BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTE
FIIR
PCHLIDE
A
UND
PCHLIDE
B
.
79
3.2.5
HEMMUNG
DER
PHOTOREDUKTION
DURCH
NICHT
PHOTOREDUZIERBARE
PIGMENTE
.
81
3.2.6
DISKUSSION
.
82
IN
INHALTSVERZEICHNIS
3.3
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DEN
SPEKTRALEN
VERSCHIEBUNGEN
VOR,
WAEHREND
UND
NACH
DER
PHOTOREDUKTION
.
88
3.3.1
DIE
ETIOPLASTENFRAKTION
YYET
"
.
89
3.3.1.1
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
30
%
GLYCERIN
.
89
3.3.1.2
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
80
%
GLYCERIN
.
91
3.3.2
DIE
FRAKTION
YYUE3
"
.
94
3.3.2.1
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
30
%
GLYCERIN
.
94
3.3.2.2
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
80
%
GLYCERIN
.
96
3.3.2.2.1
UV/VIS-SPEKTROSKOPIE
.
96
33.2.2.2
TIEFTEMPERATUR-FLUORESZENZMESSUNGEN
.
100
3.3.2.3
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
NACH
LAENGERER
PROBENLAGERUNG
OHNE
NADPH
IN
30
%
GLYCERIN
.
101
3.3.3
DIE
FRAKTION
YYEL
"
-
SPEKTRALE
VERSCHIEBUNGEN
IN
DER
FRAKTION
YYMBP-POR
"
.
103
3.3.3.1
ERGEBNISSE
DER
LIPIDISOLIERUNG
.
103
3.3.3.2
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
30%
GLYCERIN
NACH
LIPIDZUSATZ
.
105
3.3.3.3
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
80
%
GLYCERIN
NACH
LIPIDZUSATZ
.
107
3.3.4
DER
EINFLUSS
VON
LIPIDEN
AUF
DIE
SPEKTRALEN
VERSCHIEBUNGEN
DER
PHOTOREDUKTION
DURCH
UEBEREXPRIMIERTE
MBP-POR
.
110
3.3.4.1
ERGEBNISSE
DER
UEBEREXPRESSION
UND
PROTEINAUFREINIGUNG
VON
MBP-POR
IN
E.COLI
.
111
3.3.4.2
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
30
%
GLYCERIN
OHNE
LIPIDZUSATZ
.
113
3.3.4.3
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
30
%
GLYCERIN
NACH
LIPIDZUSATZ
.
113
3.3.4.4
DER
SPEKTRALE
VERLAUF
IN
80
%
GLYCERIN
NACH
LIPIDZUSATZ
.
115
3.3.4.5
VERHALTEN
VON
MBP-POR
GEGENUEBER
PIGMENTAGGREGATEN
.
118
3.3.5
DISKUSSION
.
119
3.3.5.1
MODELLVORSTELLUNGEN
ZU
DEN
MOLEKULAREN
URSACHEN
DER
PCHLIDE
A
FORMEN
.
120
3.3.5.2
SPEKTRALE
FORMEN
IN
SOLUBILISIERTEN
ETIOPLASTEN
.
122
3.3.5.3
SPEKTRALE
FORMEN
IN
DER
FRAKTION
UE3
.
126
3.3.5.4
IN
VITRO
REKONSTITUTION
DER
SPEKTRALEN
FORMEN
AUS
DER
FRAKTION
EL
UND
REKOMBINANTER
POR
(MBP-POR)
.
127
4
ZUSAMMENFASSUNG
.
135
5
LITERATURVERZEICHNIS
.
137
IV |
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