Zellbiologische Charakterisierung des PDZ- und LIM-Domäne-Proteins CLP-36:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Chemie u. Pharmazie, Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ABKUERZUNGEN
1
2
EINLEITUNG
3
2.1
HINTERGRUND
.
3
2.2
AUFGABENSTELLUNG
.
4
2.3
THEORETISCHE
GRUNDLAGEN
.
4
2.3.1
DAS
AKTINZYTOSKELETT
.
4
2.3.2
DIE
PROTEINBINDUNGSDOMAENEN
PDZ
UND
LIM
.
11
3
MATERIAL
UND
METHODEN
18
3.1
FEINCHEMIKALIEN
.
18
3.2
ENZYME
.
19
3.3
ANTIKOERPER
.
19
3.4
ZELLKULTUR
.
20
3.4.1
HUVEC-ZELLEN
.
20
3.4.2
PTK2-ZELLEN
UND
GLATTE
MUSKELZELLEN
.
21
3.5
TRANSFORMATION
VON
HUVEC-ZELLEN
UND
PTK2-ZELLEN
.
21
3.5.1
ELCKTROPORATION
DER
ENDOTHELZELLEN
.
21
3.5.2
TRANSFORMATION
VON
PTK2-ZELLEN
NACH
DER
CALCIUM-PHOSPHAT-METHODE
21
3.6
PRAEPARATION
DER
BLUTPLAETTCHEN
.
22
3.7
CLP-36
ANTI-SEREN
.
23
3.7.1
GEWINNUNG
.
23
3.7.2
REINIGUNG
DURCH
PROTEIN
A-SEPHAROSE
UND
AFFINITAETSREINIGUNG
.
24
.3.8
ISOLATION
DES
AKTINMEMBRANSKELETTS
UND
DES
ZYTOPLASMATISCHEN
AKTINZYTOSKE
LETTS
AUS
PLAETTCHENLYSATEN
.
25
3.9
PRAEPARATION
DER
AKTINBINDENDEN
PROTEINFRAKTION
AUS
BLUTPLAETTCHEN
.
26
3.10
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
27
3.10.1
MATERIAL
UND
LOESUNGEN
.
27
3.10.2
HERSTELLUNG
DES
POLYACRYLAMIDGEL
.
28
3.11
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
GEL
.
29
3.11.1
COOMASSIE-PROTEINFAERBUNG
.
29
3.11.2
SILBERFAERBUNG
.
.30
.3.12
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
.
31
INHALTSVERZEICHNIS
3.13
IMMUNOLOGISCHE
TECHNIKEN
.
32
3.13.1
WESTCRN-BLOTTING:
PROTEINTRANSFER
UND
IMMUNDETEKTION
.
32
3.13.2
IMMUNPRAEZIPITATION
.
34
3.13.3
IMMUNOPTDZ-DOWN
ASSAY
.
35
3.13.4
CYTOCHEMISCHE
IMMUNDETEKTION
DURCH
IMMUNFLUORESZENZ
UND
IMMUNOGOLD
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
36
3.14
MIKROINJEKTION
VON
ANTIKOERPER
.
39
3.15
REKOMBINANTE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
POLYHISTIDIN
UND
GST-FUSIONS
PROTEINE
.
39
3.15.1
EXPRESSION
IN
E.COLI
UND
PROTEINEXTRAKTION
.
39
3.15.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
NI-NTA-AGAROSE
.
41
3.15.3
GELFILTRATION
.
41
3.15.4
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
MIT
DEAE-SEPHAROSE
.
42
3.16
UNTERSUCHUNG
DER
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CLP-36
.
43
3.16.1
PROTEINKINASE
A-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
.
43
3.16.2
DETEKTION
DER
SERINPHOSPHORYLIERUNG
IM
IMMUNOBLOT
.
44
3.16.3
PHOSPHORYLIERUNGS-ASSAP
MIT
DEN
LIM-KINASEN
I
UND
II
.
44
3.17
AFFINITAETSBLOTTING:
BLOT-OVERLAY
ASSAY
.
45
3.18
YEAST
TWO-HYBRID
ASSAY
.
46
3.18.1
KLONIERUNG
DER
PLASMIDE
.
48
3.18.2
LITHIUM-ACETAT
TRANSFORMATION
.
49
3.18.3
/5-GALAKTOSIDASE
ASSAY
.
50
3.18.4
PRAEPARATION
VON
HEFEPROTEIN-EXTRAKTEN
.
51
3.19
VISKOELASTISCHE
MESSUNGEN
AN
AKTINNETZWERKEN
.
52
3.20
E.
CO!I-STAEMME
UND
PLASMIDE
.
54
3.21
KLONIERUNG
IN
E.COLI
UND
DNA-PRAEPARATION
.
55
3.21.1
ENZYME
.
55
3.21.2
PUFFER
.
55
3.21.3
NAEHRMEDIEN
FUER
E.COLI
UND
ZUSAETZE
.
55
3.21.4
VORGEHENSWEISE
.
56
3.21.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
KITS
.
57
3.21.6
TRANSFORMATION
DER
PLASMIDE
IN
E.
COLI
.
57
3.21.7
KLONIERUNG
DER
CLP-36-DNA
IN
PQE-30
.
57
3.21.8
KLONIERUNG
DER
CLP-36-DNA
IN
P/JACTIN-EGFP
.
58
3.21.9
STAMMHALTUNG
.
58
3.21.10SEQUENZIERUNG
.
59
3.21.11
PCR-PRIMER
.
60
3.22
UNTERSUCHUNG
DER
IN
WVO-DYNAMIK
VON
EGFP-CLP-36
DURCH
VIDEOMIKROSKOPIE
63
4
ERGEBNISSE
64
4.1
ANALYSE
DER
PRIMAERSTRUKTUR
VON
CLP-36
.
64
4.2
EXPRESSION
VON
CLP-36
.
66
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.3
ASSOZIATION
VON
CLP-36
MIT
DEM
AKTINZYTOSKELETT
IN
PLAETTCHEN,
ENDOTHELZEL
LEN
UND
GLATTEN
MUSKELZELLEN
.
68
4.4
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
LOKALISIERUNG
VON
CLP-36
IN
RUHENDEN
UND
AKTI
VIERTEN
PLAETTCHEN
.
71
4.5
KOLOKALISATION
VON
A-AKTININ
UND
CLP-36
IN
ENDOTHELZELLEN
UND
THROMBOZYTEN
74
4.6
KOIMMUNPRAEZIPITATION
DES
THROMBOZYTAEREN
A-AKTININS
MIT
ENDOGENEM
UND
EXOGENEM
CLP-36
.
77
4.7
KOORDINIERTE
TRANSLOKATION
VON
CLP-36
UND
A-AKTININ
AN
DAS
ZYTOSKELETT
AKTIVIERTER
THROMBOZYTEN
.
80
4.8
KARTIERUNG
DER
A-AKTININ-1
/
CLP-36
INTERAKTION
MIT
DEM
YEAST
TWO-HYBRID
SYSTEM
.
83
4.9
AFFINITAETSBLOTTING
MIT
BIOTINYLIERTEM
CLP-36
(BLOT-OVERLAY
ASSAY)
.
85
4.10
MIKROINJEKTION
VON
ANTI-CLP-36
ANTIKOERPER
IN
ENDOTHELZELLEN
.
88
4.11
UNTERSUCHUNG
DER
IN
VIVO
DYNAMIK
VON
FLUORESZENZMARKIERTEM
CLP-36
IN
PTK2-ZELLEN
.
90
4.12
PHOSPHORYLIENMG
VON
CLP-36
.
94
4.12.1
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEINKINASE
A
ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CLP-36
IN
F^PJ-ORTHOPHOSPHAT-MARKIERTEN
PLAETTCHEN
.
94
4.12.2
UNTERSUCHUNG
DER
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CLP-36
DURCH
DIE
LIM-KINASEN
I
UND
II
IN
VITRO
.
96
4.12.3
IMMUNDETEKTION
DER
SERINPHOSPHORYLIERUNG
VON
CLP-36
.
96
5
DISKUSSION
100
5.1
SEQUENZHOMOLOGIEN
UND
PRIMAERSTRUKTUR
.
100
5.2
EXPRESSION
VON
CLP-36
.
103
5.3
ASSOZIATION
VON
CLP-36
MIT
DEM
AKTINZYTOSKELETT
.
104
5.4
INTERAKTION
VON
CLP-36
MIT
A-AKTININ-1
.
105
5.5
INTERAKTION
VON
CLP-36
MIT
ISOFORMEN
A-AKTININ-2
UND
A-AKTININ-4
.
106
5.6
KARTIERUNG
DER
INTERAGIERENDEN
DOMAENEN
.
107
5.7
CLP-36
AUF
STRESSFASERN
.
109
5.8
IN
VIVO
DYNAMIK
VON
CLP-36
IN
PTK2-ZELLEN
.
110
5.9
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CLP-36
.
111
5.10
SCHLUSSBETRACHTUNG
.
112
6
ZUSAMMENFASSUNG
113
7
LITERATUR
116
III |
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