cAMP als zentraler Botenstoff der hyperosmotischen Stressantwort in Dictyostelium discoideum:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2000
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 2001 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG.1
2 EINLEITUNG.3
2.1 DER SEKUNDAERE BOTENSTOFF CAMP
.3
2.2 DIE ROLLE VON CAMP IN DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
.4
2.2.1 DIE ENTWICKLUNG VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM.4
2.2.2 DER C AMP-STOFFWECHSEL IN D. DISCOIDEUM.7
2.3 ZWEI-KOMPONENTEN-SIGNALTRANSDUKTION
.8
2.4 MECHANISMEN DER OSMOREGULAUEON
.11
2.4.1 OSMOTISCHER DRUCK UND TONIZITAET.11
2.4.2 OSMOREGULATION IN D. DISCOIDEUM.13
2.5 DAS HYBRID-HISTIDINKINASE-HOMOLOG DOKA
.14
2.6 ZIEL DER ARBEIT.
.15
3 ERGEBNISSE.16
3.1 DIE ROLLE VON CAMP IM HYPEROSMOTISCHEN STRESS
.16
3.1.1 HYPEROSMOTISCHER STRESS BEWIRKT IN D. DISCOIDEUM EINE ERHOEHTE
INTRAZELLULAERE CAMP-
KONZENTRATION.16
3.1.2 DOKAE-ZE\\EN WEISEN EINE VERRINGERTE INTRAZELLULAERE
CAMP-KONZENTRATION AUF.19
3.1.3 DIE AENDERUNG DER CAMP-KONZENTRATION IN ACAA'-ZELLEN AEHNELT DEM
VERLAUF IN
WILDTYPZELLEN.21
3.1.4 DIE CAMP-AENDERUNG IM OSMOSTRESS BEI UEBEREXPRESSION VON
DOKA-DOMAENEN.23
3.1.5 GEGENUEBERSTELLUNG DER BASALEN INTRAZELLULAEREN
CAMP-KONZENTRATIONEN.27
3.1.6 DIE GESAMT-CAMP-KONZENTRATION UNTER HYPEROSMOTISCHEM STRESS.29
3.1.7 DIE DOKA-ABHAENGIGKEIT DES HYPEROSMOTISCH BEDINGTEN ANSTIEGS DER
GESAMT-CAMP-
KONZENTRATION.30
3.1.8 DER HYPEROSMOTISCH BEDINGTE ANSTIEG DER GESAMT-C AMP-KONZENTRATION
IST AUCH
RDEA-ABHAENGIG.31
3.1.9 DER EXPORT VON CAMP IST IN AX2- UND DOKAE-ZELLEN NICHT
BEEINTRAECHTIGT.33
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/961285559
3.2 UNTERSUCHUNG DER OSMORESISTENZ IN STAEMMEN MIT VERAENDERTEM
CAMP-METABOLISMUS
.36
3.2.1 UEBERLEBEN VON STAEMMEN MIT VERRINGERTEM CAMP-SPIEGEL UNTER
HYPEROSMOTISCHEM
STRESS.36
3.2.2 DIE OSMOSENSITIVITAET VON
DOKAE-ZEWEN IST DURCH 8-BR-CAMP SUPPRIMIERBAR.38
3.2.3 EXTRAZELLULAERES CAMP ERHOEHT DIE UEBERLEBENSRATE VON DOKAE-ZZWEN NUR
GERINGFUEGIG.
.*.39
3.3 DIE UEBEREXPRESSION DER REGULATORDOMAENE VON DOKA VERRINGERT DIE
PHOSPHODIESTERASE-AKAEVITAET VON REGA
.41
3.4 IN VITRO-INTERAKTION VON RDEA UND DOKA-RR
.44
3.4.1 HETEROLOGE EXPRESSION DER DOKA-REGULATOR-DOMAENE IN E. COLI.44
3.4.2 DIE DOKA-REGULATOR-DOMAENE VERRINGERT DIE PHOSPHORYLIERUNG VON
RDEA.45
3.4.3 DIE REGULATOR-DOMAENE VON DOKA DEPHOSPHORYLIERT RDEA.46
3.5 VERGLEICH VON RR-ZELLEN MIT ZELLEN DIE ANDERE REGULATOR-DOMAENEN
UEBEREXPRIMIEREN
.47
3.5.1 DIE HOMOLOGE UEBEREXPRESSION WEITERER REGULATOR-DOMAENEN.48
3.5.2 ENTWICKLUNGSPHAENOTYP DER
D.
DISCOIDEUM-STAEMME DHKA-RR+ UND SSG478-RR+.49
3.6 MEMBRAN UND CYTOSKELETT ALS EFFEKTOREN BEI HYPEROSMOTISCHEM STRESS
.51
3.6.1 DIE PROTEINMENGE DER MEMBRANFRAKTION NIMMT BEI OSMOTISCHEM STRESS
ZU.51
3.6.2 VERAENDERUNGEN IM CYTOSKELETT DURCH HYPEROSMOTISCHEN STRESS.53
4 DISKUSSION. 56
4.1 CAMP IST EIN SEKUNDAERER BOTENSTOFF IM HYPEROSMOTISCHEN STRESS UND
WIRD DURCH DOKA REGULIERT
.56
I
4.2 DIE DOKA-ABHAENGIGE REGULATION DER CAMP-KONZENTRATION ERFOLGT UEBER
DEN RDEA/REGA-PHOSPHORELAY
.60
4.3 MODELL DER WIRKUNGSWEISE VON DOKA AUF DEN CAMP-METABOLISMUS IN
D. DISCOIDEUM
63
4.4 DER OSMOREGULATORISCHE SIGNALWEG IN D. DISCOIDEUM
.69
MATERIAL UND METHODEN.
75
5.1
MATERIALIEN.75
5.1.1 STAEMME. 75
5.1.2 ANTIKOERPER.76
5.1.3 ENZYME.77
5.1.4 OLIGONUKLEOTIDE.77
5.1.5 ANTIBIOTIKA.78
5.1.6 REAGENZIEN.79
5.1.7 GERAETE.81
5.1.8 SONSTIGE MATERIALIEN. 82
5.1.9 PUFFER. 83
5.1.10 MEDIEN.88
5.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
.90
5.2.1 ANZUCHT VON D. DISCOIDEUM-ZELLEN AUF AGARPLATTEN.90
5.2.2 ADHAESIVE ZUCHT VON D. DISCOIDEUM-ZELLEN IN GEWEBEKULTURSCHALEN.90
5.2.3 ANZUCHT VON D. DISCOIDEUM-ZELLEN IN SCHUETTELKULTUR.90
5.2.4 KONSERVIERUNG VON D. DISCOIDEUM-SPOREN.91
5.2.5 KONSERVIERUNG VON D. DISCOIDEUM-ZELLEN.91
5.2.6 ENTWICKLUNG VON D. DISCOIDEUM-ZELLEN AUF PHOSPHATAGAR.92
5.2.7 ENTWICKLUNG VON D. DISCOIDEUM-ZELLEN AUF CAMP-S-HALTIGERN
NORMALAGAR.92
5.2.8 TRANSFORMATION VON
D. DISCOIDEUM-ZELLEN.92
5.2.9 SORBITOLSCHOCK IN FLUESSIGKULTUR.93
5.2.10 BESTIMMUNG DER UEBERLEBENSRATE NACH HYPEROSMOTISCHEM SCHOCK.93
5.2.11 BESTIMMUNG DER UEBERLEBENSRATE NACH HYPEROSMOTISCHEM SCHOCK MIT
NUKLEOTIDZUGABE.94
5.2.12 BESTIMMUNG INTRAZELLULAERER CAMP-KONZENTRATIONEN.94
5.2.13 BESTIMMUNG DER GESAMT-CAMP-KONZENTRATION.95
5.2.14 PARALLELE BESTIMMUNG INTRA- UND EXTRAZELLULAERER
CAMP-KONZENTRATION.96
5.2.15 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI-STAEMME.96
5.2.16 TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN KOMPETENTE E. CO/I'-STAEMME.97
5.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
.97
5.3.1 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA.97
5.3.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.98
5.3.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.98
5.3.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).99
5.3.5 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN.100
5.3.6 DNA-SEQUENZIERUNG.100
5.3.7 PLASMIDISOLIERUNG AUS E. CO//-STAEMMEN.102
5.3.8 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS D. DISCOIDEUM-ZELLEN.102
5.3.9 RT-PCR.103
5.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN
.104
5.4.1 HERSTELLUNG VON LYSATEN AUS
D. DISCOIDEUM-ZELLEN.104
5.4.2 ISOLIERUNG DER CYTOSKELETTFRAKTION UND DER CYTOSOLISCHEN FRAKTION
AUS D. DISCOIDEUM-
ZELLEN.104
5.4.3 ISOLIERUNG DER MEMBRANFRAKTION AUS
D. DISCOIDEUM-ZELLEN.104
5.4.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).105
5.4.5 COOMASSIE-FAERBUNG.106
5.4.6 SILBERFARBUNG.106
5.4.7 GELTROCKNUNG. 106
5.4.8 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION.107
5.4.9 SEMI-TROCKENER WESTERN-TRANSFER (WESTERN BLOT).108
5.4.10 IMMUNFAERBUNG.108
5.4.11 COOMASSIE-FAERBUNG VON PVDF-MEMBRANEN.109
5.4.12 REINIGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.109
5.4.13 REINIGUNG VON GST-RDEA.110
5.4.14 REINIGUNG VON GST-RR BZW. GST-RRDA.111
5.4.15 AUTORADIOGRAPHIE. 111
5.4.16 IN VFRRO-32P-ISOTOPENMARKIERUNG.112
5.4.17 DEPHOSPHORYLIERUNG VON RDEA.112
5.5
BESTIMMUNG DER PHOSPHODIESTERASE-AKTIVITAET.112
6 ABKUERZUNGEN.114
7 LITERATURVERZEICHNIS
117 |
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