Ursachen erblicher Katarakte: Charakterisierung von Mutationen in den Gamma-Kristallin-Genen bei Mensch und Maus
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG.1
SUMMARY. 2
1 EINLEITUNG. .3
1.1 DIE ENTWICKLUNG DER AUGENLINSE.3
1.1.1 MORPHOGENESE DER AUGENLINSE.3
1.1.2 MOLEKULARE FAKTOREN DER AUGENENTWICKLUNG.5
1.2 DIE KRISTALLINE DER AUGENLINSEN.6
1.2.1 A-KRISTALLINE.7
1.2.2 SS-/Y-KRISTALLIN-SUPERFAMILIE.8
1.2.3 SS-KRI STALLINE.8
1.2.4 YS-KRISTALLINE.~.9
1.2.5 Y-KRISTALLINE.10
1.3
CRYG MUTATIONEN UND KATARAKTE.14
1.4 AUFGABENSTELLUNG.18
2 MATERIAL. 19
2.1 CHEMIKALIEN UND SONSTIGE REAGENZIEN.19
2.2 ENZYME UND ANTIKOERPER.20
2.3 GERAETE.20
2.4 PUFFER UND LOESUNGEN.21
2.5 GROESSENSTANDARDS.21
2.6 OLIGONUKLEOTIDE. 22
2.7 BAKTERIENSTAEMME.22
2.8 MAEUSE.22
2.9 VERWENDETE NUKLEINSAEUREN.23
2.9.1 VEKTOREN.23
2.9.2 HUMANE DNA-PROBEN.23
2.10 GENOMISCHE DNA-BANKEN.'.23
2.11 COMPUTERPROGRAMME.24
3 METHODEN.25
3.1 ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN.25
3.1.1 DNA-ISOLIERUNG AUS ORGANEN.25
3.1.2 DNA-ISOLIERUNG AUS HUMANEN BLUTPROBEN.25
3.1.3 PLASMID-DNA ISOLIERUNG AUS BAKTERIEN.25
3.1.4 DNA-ISOLIERUNG AUS ^.-PHAGEN.26
3.1.5 REINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN.26
3.1.6 RNA-ISOLIERUNG AUS ORGANEN.27
3.1.7 PHENOLEXTRAKTION.27
3.1.8 ETHANOLFAELLUNG.27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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FFL
3.1.9 QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.28
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN AN NUKLEINSAEUREN.28
3.2.1 GELELEKTROPHORESEN.28
3.2.2 DNA-SILBEMITRATFAERBUNG.29
3.2.3 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA.30
3.2.4 KLONIERUNG.30
3.2.5 CDNA ERSTSTRANG-SYNTHESE.31
3.2.6 EINZELSTRANG-KONFORMATIONS-POLYMORPHISMUS (SSCP).31
3.2.7 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 32
3.2.8 DURCHSUCHEN VON GENOMISCHEN DNA-BANKEN.34
3.2.9 HYBRIDISIERUNGSVERFAHREN (SOUTHEM-BLOT).35
3.2.10 SEQUENZIERUNG.37
3.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.37
3.3.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN.37
3.3.2 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT PLASMID-DNA.37
3.3.3 HERSTELLUNG VON GLYCERINKULTUREN. 38
3.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.38
3.4.1 HERSTELLUNG VON LINSENEXTRAKTEN.38
3.4.2 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG.38
3.4.3 FRAKTIONIERUNG VON LINSENEXTRAKTEN.38
3.4.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.39
3.4.5 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTISEREN.40
3.4.6 WESTERN-BLOT.40
3.5 MORPHOLOGISCHE UND HISTOLOGISCHE METHODEN.41
3.5.1 ORGANENTNAHME.41
3.5.2 GEWEBEFIXIERUNG.41
3.5.3 HERSTELLUNG VON PLASTIKBLOECKEN UND -SCHNITTEN.42
3.5.4 UEBERSICHTSFAERBUNG.42
3.5.5 DOKUMENTATION.42
4 ERGEBNISSE.43
4.1 UEBERSICHT DER PHAENOTYPEN DER
CAT2 KATARAKTMUTANTEN.43
4.2 ANALYSE DER
CRYG / CAT2 MUTANTEN.45
4.2.1 SYSTEMATISCHER ANSATZ ZUR UEBERPRUEFUNG DER CRYG KANDIDATENGENE.45
4.2.2 MUTATIONEN IM CRYGA GEN DER MAUS.47
4.2.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER CRYGALNEU (ENU-436) MUTANTE.47
4.2.2.2 ANALYSE DER CRYGATO1 (CAT2'1/ ENU-369) MUTANTE.51
4.2.3 ANALYSE DER CRYGBNOP (CAT2MP) MUTANTE.54
4.2.4 MUTATIONEN IM CRYGE GEN DER MAUS.56
4.2.4.1 ANALYSE DER CRYGE (CAT2L) MUTANTE.56
4.2.4.2 ANALYSE DER CRYGENS (CAT2NS) MUTANTE.57
4.2.4.3 CHARAKTERISIERUNG DER CRYGENZ (CAT2NZ) MUTANTE.64
4.2.5 UNTERSUCHUNG DER ENU-418 MUTANTE.72
4.2.6 SEQUENZUNTERSCHIEDE IN DEN CRYG GENEN DER MAUS.73
IV
4.3 UEBERSICHT UEBER MUTATIONEN IN DEN
CRYG GENEN UND DEREN EXPRESSION IN DER MAUS 75
4.4 IDENTIFIKATION EINER HUMANEN MUTATION IM
CRYGA GEN.77
5 DISKUSSION. 84
5.1 DIE Y-KRISTALLIN MUTATIONEN.84
5.1.1 UNTERSUCHUNGSMETHODEN ZUR IDENTIFIKATION VON Y-KRISTALLIN
MUTATIONEN.84
5.1.2 MUTATIONEN IN DEN Y-KRISTALLIN GENEN.85
5.1.2.1 POLYMORPHISMEN DER Y-KRISTALLINE.85
5.1.2.2 UNGEKLAERTE MUTATIONEN.87
5.1.2.3 IDENTIFIZIERTE MUTATIONEN UND MUTAGENESE.88
5.1.3 CHARAKTERISIERUNG DER CRYG GENREGION.89
5.1.4 ZEITLICHE UND RAEUMLICHE EXPRESSION DER Y-KRISTALLINE.91
5.2 KONSEQUENZEN DER MUTATIONEN AUF DIE Y-KRISTALLINPROTEINE.93
5.2.1 KURZE Y-KRISTALLIN PEPTIDE.93
5.2.2 AMINOSAEUREAUSTAUSCHE IN DEN Y-KRISTALLINEN.94
5.2.3 Y-KRISTALLINE MIT ZERSTOERTEM VIERTEN YYGRIECHISCHEN SCHLUESSEL"
MOTIV.97
5.2.4 DAS CRYGENZ-PROTEIN.98
5.2.5 MUTIERTE Y-KRISTALLINE SIND TOXISCH FUER DIE AUGENLINSE.99
5.3 KATARAKTENTSTEHUNG DURCH MUTIERTE Y-KRISTALLINE.100
5.3.1 VERBINDUNG ZWISCHEN DER EXPRESSION MUTIERTER PROTEINE UND
KATARAKT-PHAENOTYPEN 100
5.3.2 VERAENDERTE BIOCHEMIE DER KATARAKTLINSEN.102
5.3.3 VERAENDERUNGEN DER ZELLPHYSIOLOGIE IN KATARAKTLINSEN.104
5.4 AUSBLICK.105
LITERATURVERZEICHNIS.106
ANHANG.117
A.L PUFFER UND LOESUNGEN.117
ALLGEMEINE LOESUNGEN UND PUFFER.117
LOESUNGEN UND PUFFER FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.117
LOESUNGEN UND MEDIEN FUER MIKROBIOLOGISCHE METHODEN. 118
LOESUNGEN UND PUFFER FUER PROTEINCHEMISCHE METHODEN.119
LOESUNGEN FUER HISTOLOGISCHE METHODEN.120
A.2 LISTE DER VERWENDETEN OLIGONUKLEOTIDE.120
A.3 TABELLEN UND ABBILDUNGEN. 124
ABKUERZUNGEN
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