Untersuchungen zu Kohlenhydratstrukturen beim neuralen Zellerkennungsmolekül NCAM:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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INHALTSVERZEICHNIS
L.ZUSAMMENFASSUNG
.1
1.1
ABSTRACT
.
1
1.2
ZUSAMMENFASSUNG
.
2
2.
EINLEITUNG
YY
YYYYYYYY
_3
2.1
ZUCKERSTRUKTUREN
AN
ZELLERKENNUNGSMOLEKUELEN
.
3
2.2
DAS
NEURALE
ZELLADHAESIONSMOLEKUEL
(NCAM)
.
4
2.3
DIE
POLYSIALINSAEURE
(PSA)-STRUKTUR
.
5
2.4
EXPRESSION
DER
POLYSIALINSAEURE
.
6
2.5
BIOSYNTHESE
DER
POLYSIALINSAEURE
.
6
2.6
FUNKTIONEN
DER
POLYSIALINSAEURE
.
7
2.6.1
ANTI-ADHAESIVE
FUNKTIONEN
DER
PSA
.
7
2.6.2
PSA
IM
ADULTEN
GEHIRN
.
8
2.6.3
FUNKTION
DER
PSA
BEI
SYNAPTISCHER
PLASTIZITAET
.
9
2.6.4
FUNKTION
DER
PSA
BEI
KRANKHEIT,
VERLETZUNG
UND
ALTERUNG
.
10
2.6.5
ADHAESIVE
INTERAKTIONEN
DER
PSA
.
11
2.7
STRATEGIE
ZUR
ISOLIERUNG
VON
PSA-BINDUNGSPARTNEM
.
11
2.8
PHAGE
DISPLAY
.
12
3.
MATERIAL UND
METHODEN
._.YY.YY.15
3.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
15
3.2
OLIGONUCLEOTIDPRIMER
.
15
3.3
ANTIKOERPER
.16
3.4
PHAGE
DISPLAY
.16
3.4.1
AMPLIFIKATION
DER
BANK
.
16
3.4.2
SELEKTION
BINDENDER
PHAGEN
.
17
3.4.3
WEITERE
SELEKTIONSRUNDEN
.
17
3.5
PRODUKTION
UND
REINIGUNG
DER
SCFVS
.
18
3.5.1
PRODUKTION
DER
SCFVS
.
18
3.5.2
AUFREINIGUNG
DER
SCFVS
UEBER
DEN
HIS-TAG
.
18
3.6
SEQUENZIERUNG
DER
SCFVS
.
19
3.6.1
DNA-PRAEPARATION
.
19
3.6.2
KONTROLLVERDAU
.
19
3.6.3
SEQUENZIERUNG
.
19
3.7
VERKUERZUNG
DES
SCFV-FROEFER-PEPTIDES
.
20
3.7.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
20
3.7.2
AUFREINIGUNG
DES
PCR-PRODUKTES
.
20
3.7.3
RESTRIKTIONSVERDAU
.
20
3.7.4
LIGATION
DER
SCHWEREN
KETTE
V
H
UND
DEM
PHAGEMIDPHEN2
.
20
3.7.5
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
21
3.8
ELISA
(ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBANT
ASSAY)
.
21
3.8.1
ELISA
MIT
POLYKLONALEN
PHAGEN
.
21
3.8.2
ELISA
MIT
MONOKLONALEN
SCFVS
.
21
3.8.3
KOMPETITIONS-ELISA
.
22
3.8.4
ELISA
MIT
GEHIMHOMOGENATFRAKTIONEN
.
22
3.9
SPR
(SWFACE
PLASMON
RESONANCE)
.
:
.
22
3.10
FPLC-GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
23
3.11
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
.
24
3.11.1
ACETONFAELLUNG
.
24
3.11.2
CHLOROFORM/METHANOL-FAELLUNG
.
24
3.12
GELELEKTROPHORESE
.
24
3.12.1
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
24
3.12.2
GRADIENTEN-GELELEKTROPHORESE
.
25
3.12.3
2D-GELELEKTROPHORESE
.
25
3.13
GELFAERBUNGEN
.
26
3.13.1
COOMASSIE-FAERBUNG
.
26
3.13.2
SILBERFAERBUNG
.
26
3.13.3
SUEBERFARBUNGJUR
DIE
SEQUENZIERUNG
.
26
3.14
WESTERN
BLOT
.
27
3.15
PRAEPARATION
VON
GEHIMHOMOGENATEN
.
27
3.15.1
PRAEPARATION
VON
MAUS-HIMHOMOGENATEN
.
27
3.15.2
PRAEPARATION
VON
RINDER-HIMHOMOGENATEN
.
28
3.16
KOPPLUNG
VON
PROTEINEN
AN
CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
4B
.
28
3.17
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
29
3.17.1
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
GEKOPPELTEM
SCFV
.
29
3.17.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
FUER
PSA-GLYCOPROTEINE
.
29
3.17.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
FUER
PSA
UND
HNK-L-GLYCOPEPTIDE
.
30
3.18
CARBOXYMETHYLIERUNG
.
30
3.19
PROTEASEVERDAU
.
30
3.19.1
TRYPSINIERUNG/HPLC
.
30
3.19.2
ENDONEURAMINIDASE
N-VERDAU
.
31
3.20
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
31
3.20.1
P30-GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
31
3.20.2
P2-GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
32
3.21
ZUCKERANALYTIK
.
32
4
ERGEBNISSE
33
4.1
ISOLIERUNG
VON
BINDUNGSPARTNEM
FUER
DIE
POLYSIALINSAEURE
.
33
4.1.1
SELEKTION
ANTI-PSA-BINDENDER
PHAGEN
.
33
4.1.2
SPEZIFITAET
ANTI-PSA-BINDENDER
PHAGEN
.
33
4.1.3
SPEZIFITAET
MONOKLONALER
SCFVS
.
35
4.1.4
SEQUENZ
ANTI-PSA-BINDENDER
SCFVS
.
35
4.1.5
KOMPETITIONSTEST
MIT
MONOKLONALEN
SCFVS
UND
POLYMEREN
ZUCKERN
.
38
4.1.6
AUFREINIGUNG
VON
SCFV
6
UND
10
.
40
4.1.
7
SPR
MIT
AUFGEREINIGTEN
SCFVS
.
40
4.1.8
ELISA
MIT
SCFV
6
UND
10
AN
GEHIMHOMOGENATFRAKTIONEN
.
43
4.1.9
VERKUERZUNG
DES
SCFV-LINKER-PEPTIDES
.
43
4.1.10
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
LINKER-GEKUERZTEN
SCFVS
.
46
4.1.11
AUFTRENNUNG
DER
SCFVS
IN
MONO-,
DI
UND
OLIGOMERE
(FPLC)
.
49
4.1.12
SPR
MIT
MONOMER-,
DIMER
UND
OLIGOMERFRAKTIONEN
.
51
4.1.13
ELISA
MIT
SCFV
6.8
UND
10.15
AN GEHIMHOMOGENATFRAKTIONEN
.
52
4.1.14
WESTEM-BLOT-ANALYSE
MIT
DEN
LINKER-GEKUERZTEN
SCFVS
.
53
4.1.15
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
GEKOPPELTEM
SCFV
10.15
.
55
4.2
UNTERSUCHUNG
DER
ZUCKERSTRUKTUREN
DES
PSA-NCAMS
.
58
4.2.1
PSA-NCAM-AUFARBEITUNG
.
58
4.2.2
CARBOXYMETHYLIERUNG
VON
PSA-NCAM
.
62
4.2.3
TRYPSINIERUNG
VON
PSA-NCAM
.
62
4.2.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
FUER
PSA
UND
HNK-1
-GLYCOPEPTIDE
.
64
4.2.5
P30-GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
64
4.2.6
P2-GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
66
4.2.7
ANALYSE
DER
PSA
UND
HNK-1
-HALTIGEN
NCAM-GLYCOPEPTIDE
.
66
4.2.8
ANALYSE
DER
ZUCKERSTRUKTUREN
AUS
PSA-NCAM
.
70
5.
DISKUSSION
.YYYYYYYY.74
5.1
IDENTIFIZIERUNG
EINES
BINDUNGSPARTNERS
FILR
DIE
POLYSIALINSAEURE
.
74
5.1.1
ISOLIERUNG
ANTI-IDIOTYPISCHER
SCFVS
GEGEN
DEN
ANTI-PSA-ANTIKOERPER
.
74
5.1.2
BINDUNGSSTUDIEN
AN
HIMHOMOGENATEN
MIT
DEN
ANTI-PSA
MIMIKRIERENDEN
SCFVS
.75
5.1.3
AUSBLICK
.
78
5.2
ANALYTIK
DER
ZUCKERSTRUKTUREN
AN
PSA-NCAM
.
79
6.
LITERATURVERZEICHNIS
81
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.91
8.
DANKSAGUNG
.
-
YYYYYYYY.YY.YYYYYYYYYYYYYYYY.~.YYYYYY.YYYYYYYY_.YY.YY.YYYYYYYY.YYYY.YYYY.YYYYYYYYYYYYYY93
9.
LEBENSLAUF
-------------------------------------------------------------------------------------
-
-
94 |
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