Untersuchungen zur Expression von Knochenmorphogenesefaktoren in Zellen des Mammakarzinoms:
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Veröffentlicht: |
2000
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Beschreibung: | Jena, Univ., Diss., 2000 |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG. 1
1.1 STRUKTUR DER BMPS. 2
1.2 BMP-REZEPTOREN. 5
1.3 SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE UND ZIELGENE DER BMPS. 6
1.4 REGULATION DER BMP-EXPRESSION UND BMP-WIRKUNG. 10
1.5 BMPS UND KNOCHENBILDUNG. 11
1.6 BMPS IN DER EMBRYONALENTWICKLUNG. 11
1.7 BMPS NACH DER EMBRYOGENESE. 12
1.8 BMPS IN TUMOREN. 13
1.9 KLINISCHE BEDEUTUNG DER KNOCHENMORPHOGENESEFAKTOREN. 13
1.10 DAS MAMMAKARZINOM. 14
1.11 VORHABEN. 15
2. MATERIAL UND METHODEN. 17
2.1 DAS BIOLOGISCHE MATERIAL. 17
2.1.1 ZELLLINIEN. 17
2.1.2 GEWEBE. 17
2.1.3 ZELLKULTIVIERUNG. 17
2.2 RNA-ISOLIERUNG. 18
2.3 REVERSE TRANSKRIPTION (CDNA-SYNTHESE). 19
2.4 PCR. 20
2.4.1 RT-PCR.20
2.4.1.1 AUSWAHL DER PRIMER. 22
2.4.2 MULTIPLEX-(RT-)PCR. 22
2.4.3 PCR MIT DEM LIGHTCYCLER. 23
2.4.4 SEQUENZIELLE (VERLAENGERUNGS-)PCR. 24
2.4.4.1 OLIGONUKLEOTIDAUFREINIGUNG IM DENATURIERENDEN POLYACRYLAMID-
GEL. 24
2.4.4 2 HERSTELLUNG DES PAA-GELS, PROBENAUFTRAG UND
ETHIDIUMBROMIDFARBUNG. 25
2.4 4.3 ELUTION DER OLIGONUKLEOTIDE AUS DEM POLYACRYLAMIDGEL. 27
2.4.4.4 DURCHFUEHRUNG DER SEQUENZIELLEN PCR. 28
2.4.5 KOMPETITIVE PCR. 29
2.5 ANALYSE DER PCR (AGAROSE-GELLAUF).30
2.6 HERAUSLOESEN VON PCR-PRODUKTEN AUS DEM AGAROSE-GEL.31
2.7 KLONIERUNG DES BMP-KOMPETITORFRAGMENTES.32
2.8 PLASMIDISOLIERUNG.33
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/960702296
II
2.9 RESTRIKTIONSSPALTUNG.
34
2.10 SEQUENZIERUNG DES BMP-KOMPETITORFRAGMENTES.35
2.10.1 DIE KETTENABBRUCHREAKTION.36
2.10.2 HERSTELLUNG DES POLYACRYLAMIDGELS ZUR SEQUENZIERUNG.36
2.11 HERSTELLUNG DER BMP-KOMPETITORFRAGMENT-STAMMLOESUNG.37
2.11.1 GROSSPRAEPARATION VON PLASMIDEN.37
2.11.1.1 VORBEREITUNGEN. 3?
2.11.1.2 DURCHFUEHRUNG.
3?
2.11.2 RESTRIKTIONSSPALTUNG.38
2.11.3 ELUTION DES SCHNITTPRODUKTES AUS DEM AGAROSEGEL. 39
2.11.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.39
2.11.5 HERSTELLUNG DER STAMMLOESUNG.39
2.12 WESTERN BLOT. 39
2.12.1 HERSTELLUNG DES PROTEINEXTRAKTES.39
2.12.2 DIE PROTEINAUFTRENNUNG. 40
2.12.2.1 DIE DENATURIERENDE PAA-GELELEKTROPHORESE.40
2.12.2.2 DER ELEKTROTRANSFER.41
2.12.3 IMMUNDETEKTION.42
2.13 IMMUNHISTOCHEMIE AN PARAFFINSCHNITTEN.43
2.13.1 DIE VORBEHANDLUNG DER PARAFFINSCHNITTE.43
2.13.1.1 ENTPARAFFINIEREN.43
2.13.1.2 MIKROWELLENBEHANDLUNG.43
2.13.1.3 H202-BEHANDLUNG.44
2.13.1.4 NORMALSERUMBEHANDLUNG.
44
2.13.2 DIE ANTIKOERPERINKUBATIONEN.44
2.13.2.1 PRIMAER-ANTIKOERPER.44
2.13.2.2 SEKUNDAER-ANTIKOERPER.45
2.13.3 NACHWEIS MIT DER AVIDIN-BIOTIN-METHODE.45
2.13.3.1 DURCHFUEHRUNG.
45
2.13.3.2 AUSWERTUNG.
46
2.14
IMMUNHISTOCHEMIE AN MAMMAKARZINOMZELLLINIEN.48
3. ERGEBNISSE.
YY
/
.50
3.1 HERSTELLUNG DES BMP-KOMPETITORFRAGMENTES.50
3.1.1 AUSWAHL DER PRIMER. 50
3.1.2 ANORDNUNG DER PRIMERBINDUNGSSTELLEN.51
3.1.3 SYNTHESE DES BMP-KOMPETITORFRAGMENTES.52
3.1.3.1 DIE SYNTHESE-STRATEGIEN.53
3 1.3.2 AUFREINIGUNG DER OLIGONUKLEOTIDE IM DENATURIERENDEN PAA-GEL.
55
3'L'3.3 SEQUENZIELLE PCR.56
3.1.4 KONTROLLE DES FERTIGGESTELLTEN BMP-KOMPETITORFRAGMENTES.57
3.1.4.1 SEQUENZIERUNG.57
3.1.4.2 SPEZIFISCHE PCR.58
IN
3.1.4.3 DAS BMP-KOMPETITORFFAGMENT ALS STANDARD
IN DER LIGHTCYCLER-PCR.61
3.2 SEMI-QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER BMP-MRNA IN
TUMORZELLLINIEN.62
3.2.1 OESOPHAGUSKARZINOMZELLLINIEN.63
3.2.2 MAMMAKARZINOMZELLLINIEN.66
3.3 EXPRESSION VON BMP-7 IN MAMMAKARZINOMZELLLINIEN.70
3.3.1 EXPRESSION VON BMP-7 AUF MRNA-EBENE.70
3.3.2 EXPRESSION VON BMP-7 AUF PROTEINEBENE.71
3.3.2.1 QUANTITATIVER BMP-7-NACHWEIS IM WESTEMBLOT.71
3.3.2.2 IMMUNHISTOCHEMISCHER BMP-7-NACHWEIS.73
3.4 EXPRESSION VON BMP-7 IN MAMMAKARZINOMGEWEBEPROBEN.74
3.4.1 BMP-7-MRNA-EXPRESSION IN TUMOR- UND NORMALGEWEBE
DER MAMMA.74
3.4.2 IMMUNHISTOCHEMISCHER BMP-7-NACHWEIS AN ^
MAMMAKARZINOMGWEBESCHNITTEN.76
3.4.3 TUMORBIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON BMP-7.78
3.4.3.1 BMP-7 UND PROGNOSTISCHE PARAMETER.80
4. DISKUSSION.87
5. ZUSAMMENFASSUNG.99
6. LITERATURVERZEICHNIS
. I
7. ANHANG
VEROEFFENTLICHUNGEN
DANKSAGUNG
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
LEBENSLAUF |
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