Evaluierung isotopischer versus nichtradioaktiver In-vitro- und In-situ-Hybridisierungen zum Nachweis enteroviraler RNA in Modellsystemen der viralen Herzerkrankung:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
|
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| Beschreibung: | Hamburg, Univ., Diss., 1998 |
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1.
Z
USAMMENFASSUNG
.
I
2.
E
INLEITUNG
.
5
2.1.
DIE
VIRALE
MYOKARDITIS
UND
DEREN
ERREGER
.
5
2.1.1.
EINFUEHRUNG
.
5
2.1.2.
AETIOLOGIE
DER
MYOKARDITIS
.
6
2.1.3
COXSACKIEVIREN
-
HUMANPATHOGENE
ENTEROVIREN
AUS
DER
FAMILIE
DER
PICORNAVIREN:
KLASSIFIKATION
.
7
2.1.4
MOLEKULARE
ORGANISATION
DES
COXSACKIEVIRUSGENOMES
.
8
2.1.5
INFEKTIONSZYKLUS
DER
COXSACKIEVIREN
.
9
2.1.6
FORMALE
PATHOGENESE
HUMANER
COXSACKIEVIRUSINFEKTIONEN
.
11
2.1.7
SYMPTOMATOLOGIE
UND
DIAGNOSTIK
DER
MYOKARDITIS:
BEDEUTUNG
DES
DIREKTEN
NACHWEISES
ENTEROVIRALER
RNA
IM
GEWEBE
.
13
2.2
NICHTRADIOAKTIVE
NUKLEINSAEUREHYBRIDISIERUNGS
UND
NACHWEISMETHODEN
.
15
2.2.1
METHODISCHE
VOR-UND
NACHTEILE
.
15
1.12
STELLENWERT
DER
ISOTOPISCHEN
UND
DER
NR
ISH
FUER
DIE
ENTEROVIRUS
DIAGNOSTIK
.
17
2.3
RATIONALE
UND
ZIELSETZUNGEN
DER
ARBEIT
.
18
3,
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
3.1
MATERIAL
3.1.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
20
3.1.2
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
.
22
3.1.3
NUKLEOTIDE
.
22
3.1.4
SONSTIGE
MATERIALIEN
UND
SUBSTANZEN
FUER
IN
VITRO
UND
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
22
3.1.5
NUKLEINSAEUREN
UND
PLASMIDE
.
23
3.1.6
ANTIKOERPER
.
23
3.1.7
ZELLINIEN
UND
GEWEBE
.
23
3.1.8
ZELLKULTURMEDIEN
.
23
II
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.2
ARBEITSMETHODEN
MIT
DNA
.
24
3.2.1.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
.
24
3.2.1.1
PHENOLEXTRAKTION
.
24
3.2.1.2
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
25
3.2.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
I
.
25
3.2.2
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
CDNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
25
3.2.3
S'-TERMINAIE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
MIT
T4-POLYNUKLEOTID-
KINASE
UND
ENDMARKIERUNG
.
26
3.2.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
27
3.2.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
28
3.2.6
HERSTELLUNG
VEKTOR-FREIER
CDNA
DURCH
HYBRIDISIERUNG
MIT
PARTIKELGEBUNDENER
PBR322
EINZELSTRANG-DNA
IN
SUSPENSION
UND
MAGNETSEPARATION
.
29
3.2.7
REDUKTION
DER
CDNA-FRAGMENTLAENGEN
DURCH
LIMITIERTE
DNASE
I
RESTRIKTION,
SPEZIFISCHE
RESTRIKTION
MIT
TYP
II
ENDONUKLEASEN
UND
ULTRASCHALLBEHANDLUNG
.
30
3.2.8
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
NICKTRANSLATION
.
31
3.2.9
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
RANDOM-PRIMED-
LABELING
(RPL)
.
32
3.2.10
DARSTELLUNG
SYNTHETISCHER
DNA-OLIGONUKLEOTIDE
.
34
3.2.10.1
HERSTELLUNG
.
34
3.2.10.2
GELELEKTROPHORETISCHE
REINIGUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.
35
3.2.11
ISOTOPISCHE
UND
NR
NUKLEINSAEUREMARKIERUNG
MIT
DER
POLYMERASE
KETTEN
REAKTION
(PCR)
.
35
3.2.12
CHEMISCHE
MODIFIKATION
VON
CDNA
DURCH
SULFONYLIERUNG
.
37
3.2.13
SEPHADEX
G50-SAEULENZENTRIFUGATION
.
37
3.2.14
QUANTIFIZIERUNG
DER
EINBAURATE
NICHTRADIOAKTIVER
NUKLEOTIDE
UND
DER
MENGE
MODIFIZIERTER
CDNA
.
38
3.2.15
DNA
DOT-BLOTS
.
39
3.2.16
SOUTHERN TRANSFER
.
40
3.2.17
PROTOKOLLE
FUER
DEN
IN
VITRO
NACHWEIS
VON
NICHTRADIOAKTIV
MARKIERTER
CDNA
.
40
3.3
MOLEKULARE
STRUKTURANALYSEN
.
43
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.4
ARBEITSMETHODEN
MIT
RNA
.
44
3.4.1
ISOLIERUNG
CYTOPLASMATISCHER
RNA
AUS
EUKARYONTEN
ZELLEN
.
44
3.4.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
45
3.4.3
IN
VITRO
HYBRIDISIERUNG
GEGEN
MEMBRANTRANSFERIERTE
RNA
.
47
3.5
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
RNA
.
48
3.6
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
48
3.6.1
VORBEHANDLUNG
VON
OBJEKTTRAEGERN
UND
DECKGLAESCHEN
.
49
3.6.2
FIXIERUNG
VON
ZELLEN
UND
GEWEBESCHNITTEN
.
49
3.6.3
VORBEREITUNG
DER
ZELL
UND
GEWEBEPROBEN
FUER
DIE
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
50
3.6.4
HYBRIDISIERUNG
DER
SONDEN
.
51
3.6.5
POSTHYBRIDISIERUNG
.
52
3.6.6
BEFILMEN
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
52
3.6.7
ENTWICKLUNG
ISOTOPISCHER
SIGNALE
.
52
3.6.8
ENTWICKLUNG
NICHTRADIOAKTIVER
SIGNALE
.
53
3.7
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
54
3.7.1
KULTIVIERUNG
VON
NICHTINFIZIERTEN
UND
INFIZIERTEN
ZELLEN
.
54
3.7.1.1
ZELLKULTURBEDINGUNGEN
.
54
3.7.1.2
VIABILITAETSPRUEFUNG
AN
KULTIVIERTEN
ZELLEN
.
55
3.7.2
VIROLOGISCHE
METHODEN
.
56
3.7.2.1
PLAQUE-REINIGUNG
VON
COXSACKIEVIRUS
B3
.
56
3.7.2.2
VIRUSVERMEHRUNG
.
56
3.7.2.3
PLAQUE-TEST
ZUM
QUANTITATIVEN
VIRUSNACHWEIS
.
57
3.7.2.4
CVB3
INFEKTION
VON
KULTIVIERTEN
ZELLEN
.
58
3.7.2.5
INFEKTION
VON
MAEUSEN
MIT
CVB3
.
58
3.8
ANFERTIGUNG
VON
MYOKARDSCHNITTEN
.
58
3.9.
SICHERHEITSMASSNAHMEN
.
59
IV
I
NHALTSVERZEICHNIS
4.
E
RGEBNISSE
.
60
4.1
ETABLIERUNG
UND
VERGLEICHENDE
EVALUIERUNG
VON
NICHTRADIO
AKTIVEN
(NR)
NUKLEINSAEUREMARKIERUNGS-,
HYBRIDISIERUNGS
UND
DETEKTIONSMETHODEN
IN
VITRO
.
60
4.1.1
OPTIMIERUNG
VON
NR
MARKIERUNGSREAKTIONEN
.
60
4.1.1.1
DARSTELLUNG
UND
SELEKTION
DEFINIERTER
CVB3
CDNA
FRAGMENTE
ZUR
VERWENDUNG
ALS
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
UNTERSCHIEDLICHEN
DNA
MARKIERUNGSMETHODEN
.
60
4.1.1.2
EVALUIERUNG
GEEIGNETER
MISCHUNGSVERHAELTNISSE
VON
CVB3
CDNA
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
FUER
NR
MARKIERUNGSREAKTIONEN
UND
STANDARDISIERUNG
DER
SONDENLAENGE
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
SENSITIVITAET.
62
4.1.1.3
NICHTRADIOAKTIVE
CDNA
MARKIERUNG
MIT
DER
PCR:
EFFIZIENZ
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
VERSCHIEDENEN
NR
NUKLEOTIDEN
.
64
4.1.1.4
EINFLUSS
DES
MARKIERUNGSGRADES
VON
CDNA
MIT
NR
HAPTENEN
AUF
DIE
SENSITIVITAET
DES
NR
IN
VITRO
NACHWEISES
FILTERGEBUNDENER
UND
GEGEN
CVB3-RNA
HYBRIDISIERTER
SONDEN
.
68
4.1.2
OPTIMIERUNG
DER
SPEZIFITAET
UND
SENSITIVITAET
VON
NR
NUKLEINSAEURE-
HYBRIDISIERUNGS
UND
NACHWEISREAKTIONEN
IN
VITRO
.
69
4.1.2.1
OPTIMIERUNG
DER
NACHWEISSENSITIVITAET
NR
MARKIERTER
SONDEN
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DEN
VERWENDETEN
CDNA
SEQUENZEN
UND
DEN
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
.
69
4.1.2.2
OPTIMIERUNG
DES
SIGNAL/HINTERGRUND
(S/H)
VERHAELTNISSES
VON
NR
IN
VITRO
HYBRIDISIERUNGS
UND
NACHWEISTECHNIKEN
.
72
4.1.3
VERGLEICH
DER
SPEZIFITAET
UND
SENSITIVITAET
VON
NR
IN
VITRO
NACHWEIS
REAKTIONEN
UNTERSCHIEDLICH
MARKIERTER
CVB3
CDNA
SOWIE
VON
IN
VITRO
HYBRIDISIERUNGEN
GEGEN
CVB3
RNA
MIT
VERSCHIEDENEN
NR
MARKIERTEN
SONDEN
.
80
4.1.3.1
SPEZIFITAET
VON
UNTERSCHIEDLICH
MARKIERTEN
NR
CVB3
CDNA
SONDEN
BEI
HYBRIDISIERUNGEN
GEGEN
DIVERSE
PICORNAVIREN
.
80
4.1.3.2
VERGLEICH
DER
SENSITIVITAET
VON
VERSCHIEDENEN
CDNA
NACHWEIS
METHODEN
.
83
4.1.3.3
VERGLEICH
DER
NACHWEISSENSITIVITAETEN
VON
MIT
VERSCHIEDENEN
METHODEN
HERGESTELLTEN
NR
CDNA
SONDEN
.
87
4.1.3.4
VERGLEICH
DER
NACHWEISSENSITIVITAETEN
VON
MIT
VERSCHIEDENEN
NR
NUKLEOTIDEN
IN
DER
PCR
SYNTHETISIERTEN
NR
CDNA
SONDE
.
89
V
I
NHALTSVERZEICHNIS
4.1.3.5
SENSITIVITAET
VON
NR
CDNA
SONDEN
IN
HYBRIDISIERUNGSREAKTIONEN
GEGEN
CVB3
RNA
.
91
4.1.3.6
HYBRIDISIERUNG
VON
PCR-MARKIERTEN
NR
CDNA
SONDEN
GEGEN
IN
VITRO
SYNTHETISIERTE
CVB3
RNA
TRANSKRIPTE
.
95
4.1.4
Z
WISCHENZUSAMMENFASSUNG
.
96
4.2
EVALUIERUNG
VON
NR
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGS
UND
NACHWEIS
REAKTIONEN
.
99
4.2.1
OPTIMIERUNG
DER
NR
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
99
4.2.1.1
OPTIMIERUNG
DER
ZELL
UND
GEWEBEVORBEHANDLUNG
SOWIE
DER
HYBRIDISIERUNGS
UND
NACHWEISKINETIK
.
99
4.2.1.2
OPTIMIERUNG
DES
SIGNAL/HINTERGRUNDVERHAELTNISSES
VON
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
102
4.2.2
ETABLIERUNG
UND
VERGLEICHENDE
EVALUIERUNG
DER
NR
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
108
4.2.2.1
DARSTELLUNG
DER
ENTEROVIRUS-INFEKTION
IN
BIO-MODELLEN
MIT
HILFE
VON
NR
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
108
4.2.2.2
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
GEGEN
CVB3
INFIZIERTE
ZELLEN
MIT
IN
DER
PCR-MARKIERUNG
HERGESTELLTEN
SONDEN
.
114
.
4.2.2.3
SENSITIVITAET
NICHTRADIOAKTIVER
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
117
4.2.2.4
ZEITBEDARF
FUER
NR
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN:
VORTEILE
DER
MIKROWELLEN
ANWENDUNG
.
118
5.
D
ISKUSSION
5.1
NR
NUKLEINSAEUREHYBRIDISIERUNGSMETHODEN:
VERGLEICH
BISHERIGER
EVALUIERUNGEN
.
120
5.2
STRATEGIEN
ZUR
OPTIMIERUNG
VON
NR
NUKLEINSAEUREHYBRIDISIERUNGS
UND
NACHWEISVERFAHREN
.
124
5.3
NACHWEISSPEZIFITAET
UND
REPRODUZIERBARKEIT
VON
IN
VITRO
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
VERSCHIEDENEN
NR
CDNA-SONDEN
GEGEN
ENTEROVIRALE
RNA
.
126
I
NHALTSVERZEICHNIS
6
5.4
QUANTITATIVE
EVALUIERUNGEN
.
127
5.4.1
SENSITIVITAET
DER
NR
IN
VITRO
HYBRIDISIERUNGSMETHODEN
GEGEN
ENTEROVIRAIE
RNA
.
127
5.4.2
THEORETISCHE
ERWAEGUNGEN
ZUR
NR
NUKLEINSAEUREMARKIERUNG
UND
ZU
NR
NACHWEISREAKTIONEN
.
130
5.5
SPEZIFITAET
DER
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
133
5.6
SENSITIVITAET
DER
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGEN
.
135
5.7
ANWENDUNG
VON
MIKROWELLENSTRAHLEN
ZUR
BESCHLEUNIGUNG
DER
NR
ISH
.
137
5.8
NR
VERSUS
ISOTOPISCHE
ISH:
PRAKTISCHE
ASPEKTE
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCH
DIAGNOSTISCHE
LABORATORIEN
UND
PERSPEKTIVEN
FUER
WEITERENTWICKLUNGEN
138
6.
L
ITERATURVERZEICHNIS
.
142
7.
A
BKUERZUNGEN
.
159
8.
D
ANKSAGUNGEN
.
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