Vergleichende Untersuchungen zur Transaktivierung von Zielgenen durch den Transmembranrezeptor Notch und das Epstein-Barr-Virus nukleäre Antigen 2 (EBNA2):
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Diss.-Verl. NG-Kopierladen
2001
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| Beschreibung: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 2001 |
| Beschreibung: | V, 107 S. Ill., graph. Darst : 21 cm |
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1. EINLEITUNG 1
1.1. Notch: ein hochkonservierter Transmembranrezeptor 1
1.2. Das Notch Protein 2
1.3. Mechanismus der Notch Signaltransduktion 3
1.4. Notch und Zelldifferenzierung 4
1.5. Notch und Zelltransformation 5
1.6. Notch Ziclgene 6
1.7. Das virale Protein EBNA2 benutzt den Notch Signahveg 7
1.7.1. Schlüsselrolle von EBNA2 bei der B Zell Immortalisierung durch EBV 7
1.7.2. Das EBNA2 Protein 8
1.8. EBNA2 Zielgene 9
1.9. EBNA2 und Notch Zielgene 10
1.10. Die Zellinie EREB 2 5 und darauf basierende Zellsysteme: Werkzeuge zur
Ermittlung von EBNA2 und Notch induzicrten Genen 11
1.11. Fragestellungen der Arbeit 12
2. MATERIAL 14
2.1. Zellinien 14
2.2. Material für die Zellkultur 15
2.3. Bakterienstämme 15
2.4. Plasmide 15
2.5. Antikörper 16
2.6. Enzyme 16
2.7. Reagentiensysteme/Kits 17
2.8. Primcr und Oligonukleotide 17
2.9. Radioaktive Isotope 18
2.10. Chemikalien und weitere Materialien 18
3. METHODEN 20
3.1. Arbeiten mit Bakterienkulturcn 20
3.1.1. Kultur und Aufbewahrung von Bakterien 20
I
3.1.2. Herstellung kompetenter Bakterien 20
3.1.3. Transformation 20
3.1.4. Präparation von Plasmid DNA 21
3.2. Molekularbiologische Arbeiten mit DNA 21
3.2.1. Agarose Gelelektrophorese 21
3.2.2. Extraktion und Reinigung von DNA aus Agarosegelen 22
3.2.3. Enzymatische Behandlung von DNA 22
3.1.3.1. Spaltung mit Restriktionsenzymen 22
3.1.3.2. Auffüllen überhängender Enden 22
3.1.3.3. Behandlung mit alkalischer Phosphatase 22
3.1.3.4. Ligation 22
3.1.3.5. Polymerasekettenreaktion (PCR) undRT(Reverse Transkription) PCR 23
3.1.3.6. Radioaktive Markierung von DNA Proben mit a s2P dCTP 24
3.1.3.7. Kinasierung eines Oligonukleotids mit y12P ATP 24
3.2.4. Plasmidkonstruktionen 24
3.2.4.1. UmklonierungderNotch Deletionskonstrukte 24
3.2.4.2. Klonierung des Notch EBNA2 Fusionskontrukts 25
3.3. Auf Zellkultur basierende Methoden 25
3.3.1. Kultur und Aufbewahrung von Zellen 25
3.3.2. Auswaschen der Zellen 26
3.3.4. Isolierung von RNA 26
3.3.5. Transiente Transfektionen 26
3.3.5.1 Transfektion von adhärenten Zellen mit Calciumphosphal oder Lipofectamin 26
3.3.5.2. Elektroporation 27
3.3.6. Luciferase Aktivitätsbestimmung 27
3.3.7. Agar Transformationstest 27
3.3.8. Präparation von Proteinextrakten für die SDS PAGE 28
3.4. Charakterisierung von Proteinen 28
3.4.1. Quantifizierung 28
3.4.2. Auftrennung von Proteinen durch SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS
PAGE) 29
3.4.3. Western Blot Analyse 29
3.5. Charakterisierung von RNA 30
3.5.1. Agarose Gelelektrophorese 30
3.5.2. Northern Blot Analyse 30
3.6. Herstellung radioaktiv markierter Proben zur Hybridisierung der Atlas cDNA
Filter 31
4. ERGEBNISSE 32
4.1. Notch besitzt eine intrinsische Transaktivierungsdomäne im C terminalen
Bereich 32
4.2. Rolle der Transaktivierungsdomäne und der RAMANK Domäne bei der
Aktivierung RBPjK abhängiger Promotoren durch Notch IC 35
4.2.1. Die Transaktivierungsdomäne wird für die Aktivierung der HES1 und HES5
Promotoren benötigt 35
4.2.2. Die Transaktivierungsdomäne und die RAMANK Domäne sind beide an der
Aktivierung RBPjK abhängiger Promotoren beteiligt 37
4.3. Der Mechanismus der Aktivierung RBPJic abhängiger Promotoren durch die
RAMANK Domäne: Transaktivierung oder Aufhebung der Repression? 39
4.4. E1A und die ANK Domäne kooperieren bei der neoplastischen Transformation
von RK3E Zellen 40
4.5. Nicht alle RBPJK abhängigen Promotoren werden sowohl durch EBNA2 als
auch durch Notch IC aktiviert 44
4.5.1. Die unterschiedliche Stärke der Aktivierung viraler Promotoren durch Notch IC
und EBNA2 läßt sich nicht auf die Eigenschaften ihrer Transaktivierungs¬
domänen zurückführen 44
4.5.2. EBNA2 kann die RBPJK abhängigen Promotoren der Notch Zielgene HES 1
und HES 5 nicht induzieren 46
4.6. Suche nach EBNA2 regulierten Genen in den Zellinien EREB 2 5, EREB Notch
und EREB Myc mit Hilfe von „Atlas™ cDNA Expression Arrays 48
4.7. Zuordnung der neuen EBNA2 Zielgene in spezifische Signalwege, die von
EBNA2 benutzt werden 54
4.7.1. Überprüfung des Phänotyps der Zellinien EREB 2 5, EREB Notch, EREB LMP1
und EREB Myc 57
4.7.2. Indirekte EBNA2 Zielgene, die durch Myc aktiviert werden 60
4.7.3. Das indirekte EBNA2 Zielgen VEGF wird durch LMP1 induziert 62
4.7.4. Identifizierung von EBNA2 und Notch Zielgenen 64
4.7.5. Transiente Regulation von TNFoc durch EBNA2 66
III
4.8. Charakterisierung von EBNA2 Zielgenen, die unabhängig von Myc, LMP1 und
Notch reguliert werden 67
4.9. Zusammenfassung der neu charakterisierten EBNA2 Zielgene 71
5. DISKUSSION 73
5.1. Die Notch vermittelte Transaktivierung wird von zwei Mechanismen gesteuert.... 73
5.1.1. Notch besitzt eine C terminal gelegene, transferierbare TAD 73
5.1.2. Die RAMANK Domäne, eine nicht transferierbare TAD, aktiviert ausschließlich
RBPJK abhängige Promotoren 74
5.2. Vergleich der Transaktivierungsdomänen von Notch IC und EBNA2 76
5.3. RBPJk, Notch IC und EBNA2 modulieren die Aktivität des Chromatins 77
5.4. Die ANK Domäne von Notch IC ist essentiell für die Zelltransformation 79
5.5. Die Methode der Atlas cDNA Filter Hybridisierung zur Ermittlung neuer
EBNA2 Zielgene 80
5.6. Regulation der EBNA2 Zielgene 81
5 6.1. Direkte EBNA2 Zielgene 81
5.6.2. Indirekte EBNA2 Zielgene 82
5.6.3. Notch und EBNA2 Zielgene 82
5.6.4 Reprimierte EBNA2 Zielgene 84
5.7. Funktion der EBNA2 Zielgene 84
5.7.1. Myc Zielgene 84
5.7.2. Das LMPl Zielgen VEGF 85
5.7.3. Die EBNA2 Zielgene ICAM 1, CD40 und CD70 85
5.7.4. Notch und EBNA2 Zielgene 86
5.7.5. Reprimierte Zielgene 86
5.8. Vernetzung der EBNA2 Zielgene 87
5.8.1. ERF 1 reguliert möglicherweise die TNFa Produktion 87
5.8.2. Vernetzung der Signalwege von EBNA2 und LMP1 bei der Induktion von
ICAM 1, CD21, CD23 und CD40 87
5.9. Ausblick 88
6. ZUSAMMENFASSUNG 88
7. LITERATUR 89
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