Klonierung und Charakterisierung des Peptidtransporter-Gens Pept2 der Maus:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 8
1.1 DIE PEPTIDTRANSPORTER BILDEN EINE KONSERVIERTE FAMILIE ELEKTROGENER
CARRIER
PROTEINE MIT ZENTRALER BEDEUTUNG FUER DIE HOMOEOSTASE VON AMINO-STICKSTOFF
8
1.2 DIE MITGLIEDER DER POT-FAMILIE AUF GENOMISCHER EBENE 14
1.3 EINSATZ VON NEUEN TIERMODELLEN (KNOCKOUT-MAEUSE) ZUR AUFKLAERUNG DER
PHYSIOLOGISCHEN BEDEUTUNG VON TRANSPORTPROTEINEN 15
1.4 ZIELE DER ARBEIT 18
2 MATERIALIEN UND METHODEN
20
2.1 MATERIALIEN 20
2.1.1 VERSUCHSTIERE 20
2.1.2 ZELLEN 20
2.1.3 RADIOAKTIV-MARKIERTE TESTVERBINDUNGEN 20
2.1.4 GERAETE 20
2.1.5 CHEMIKALIEN, MOLEKULARBIOLOGISCHE REAGENTIEN UND ZELLKULTURBEDARF
21
2.2 METHODEN 21
2.2.1 PCR, POLYMERASE-KETTENREAKTION 21
2.2.2 RT-PCR, REVERSE-TRANSKRIPTION-PCR 22
2.2.3 RACE, YYRAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS" 22
2.2.4 KLONIERUNG DER PCR- UND RACE-PRODUKTE 24
2.2.5 EXPRESSION DES PEPT2-PROTEINS IN
XENOPUS LAEVIS OOCYTEN 24
2.2.6 HOMOLOGIE-SCREENING 26
2.2.7 PAC-DNA-ISOLIERUNG 28
2.2.8 SUBKLONIERUNG VON PAC-DNA-FRAGMENTEN 29
2.2.9 WESTEM-BLOT 30
2.2.10 SOUTHEM-BLOT 30
2.2.11 NORTHEM-BLOT 31
2.2.12 RADIATION HYBRID MAPPING 31
2.2.13 PROMOTOR-ANALYSE 32
2.2.14 HERSTELLUNG EINER KNOCKOUT-MAUS 37
2.2.15 DNA-SEQUENZIERUNG 44
2.2.16 SEQUENZANALYSEN 44
2.2.17 DATENANALYSEN 44
4
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3 ERGEBNISSE 46
3.1 MOLEKULARE IDENTIFIZIERUNG DER RENALEN PEPTIDTRANSPORTER-CDNA AUS
DER MAUS 46
3.1.1 ISOLIERUNG DER MURINEN PEPT2-CDNA 46
3.1.2 MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG 47
3.1.3 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG 53
3.2 IDENTIFIZIERUNG DES MURINEN
PEPT2-GENS 56
3.2.1 ISOLIERUNG DES RENALEN PEPTIDTRANSPORTER-GENS 56
3.2.2 ORGANISATION DES MURINEN PEPTIDTRANSPORTER-GENS
PEPT2 59
3.2.3 IDENTIFIZIERUNG DER PROMOTORREGION DES MURINEN PEPT2-GENS 68
3.3 VORARBEITEN FUER DIE HERSTELLUNG EINER PE/ F2-KNOCKOUT-MAUS
(PEPT2~/) 71
3.3.1 HERSTELLUNG DES TARGETING-KONSTRUKTS 72
3.3.2 HOMOLOGE REKOMBINATION VON PPEPT2TGL IN ES-ZELLEN 74
3.3.3 INJEKTION DER REKOMBINANTEN ES-KLONE IN BLASTOCYSTEN UND TRANSFER
77
3.3.4 PRUEFUNG DER KEIMBAHNTRANSMISSION 78
4 DISKUSSION BO
5 ZUSAMMENFASSUNG 92
ANHANG 94
I LITERATURVERZEICHNIS 94
II ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 100
III PLASMIDE, PRIMER UND LINKER 102
IV DANKSAGUNG 105
V LEBENSLAUF 106
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