Identifizierung genetischer Veränderungen in der frühen Phase der HPV-bedingten Tumorentstehung:
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| adam_text | Titel: Identifizierung genetischer Veränderungen in der frühen Phase der HPV-bedingten Tumorentstehung
Autor: Wagenbach, Nikola
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 5
1.1 Papillomviren als Krebserreger 5
1.2 Klassifizierung und struktureller Aufbau der Papillomviren 6
1.3 Biologie der Papillomviren 9
1.4 Transformierende Funktion der Papillomviren 10
1.5 Zellkultur-Modellsystem 11
1.6 Zelluläre Seneszenz - ein Tumorsuppressor-Mechanismus 12
1.7 Fragestellung und Zielsetzung 16
2 MATERIAL 17
2.1 Chemische Reagentien 17
.1 Salze 17
1.2 Säuren und Basen 17
.3 Organische Lösungsmittel und Substanzen 17
4 Substanzen für die Zellkultur 18
.5 Enzyme 19
6 Chromosomen (Hybridisierungssonden) 19
17 Antikörper 19
2.2 Verhrauchsmaterialien 19
2.3 Geräte 20
2.4 Zellkultunnaterialien 22
2.4.1 Zellkulturmedien 22
2 4.1 1 Dulbeccos modified minimal essential medium (DMEM) 22
2.4 2 Herstellung von Stocklösungen 22
2 4.2 lGeneticinG418 22
2 4.2.2 500x HAT 22
2.4.2.3 5 x HT 22
2.4.2.4 Trypsinlösung 22
2.4.2.5 Einfriermedium 23
2.4.2.6 Selektionsmedien 23
2.4.2.7 PBS 23
2 4 3 Zellen 24
2.4.3.1 Empfänger-Zellinien 24
2 4.3.2 Donorzellinien 24
2 4 4 Lösungen für Fusion 25
2.4.4.1 Cokxmid 25
2 4 4 2 C 1ochalasin B 25
2.4.4.3 pfrytohämagglutinin-P (PHA-P) 25
2 4 4 4 Zusatzmaterialien 25
2.5 Losungen für DNA-Pripantion 25
2.5 I Präparation zellularer DNA 25
2.5 l I 3x DNA-Lysepuffer 25
2.5.1.2 HomogenisierungspufTer 26
2.5. l .3 Chloroform/Isoamvlalkohol (CIA) 26
Inhaltsverzeichnis
2.6 Material für Dinuckotid-Repeat-PCR 26
2.6.1 Oligonucleotid-Primer für Chromosome 4 26
2.6.2 Oligonucleotid-Primer für Chromosom 20 27
2.6.3 Losungen und Puffer für die Potyacrylamid-Harnstoffgele 27
2.6.3.1 lOx TBE-Puffer pH 8,8 (Elektrophorese-Puffer) 27
2.6.3.2 Bindesilart-Losung 28
2.6.3.3 40 % Acrylamid-Bis-Acrylamid-Stammlösung (20:1) 28
2.6.3.4 Polyacrylamid-Harnstoff-Arbeitslösung (6%) 28
2.6.4 Puffer und Losungen für DNA-Agarosegele 28
2.6.4.1 Elektrophorese-Puffer (50x EP), pH 7,8 28
2.6.4.2 Ladepuffer BromphcnolbLau (6x BPB) 29
2.7 Lösingen und Puffer für FISH 29
2.7.1 Lösungen für die Metaphasenpräparation 29
2.7.1.1 Fixierlösung: 29
2.7.2 Material für die Hybridisierung 29
2.7.2.1 Proben-DNA: 29
2.7.2.2 Denaturierungslösung: 29
2.7.3 Material für Probendeteküon 30
2.7.3.1 Waschpuffer!: 3Ü
2.7.3.2 Waschpuffer II: 30
2.7.3.3 Waschpuffer III: 30
2.7.3.4 Blockierlesung: 30
2.7.3.5 Detektionslösung: 30
2.7.3.6 Gegenfärbung: 30
2.7 3.7 Waschpuffer für „poststaining wasn : 3I
2.7 3.8 Überschichtungsmedium („Mounüng medium ): -* 1
2.8 DNA-DNA Hybridirierungen (für Skrt-Blot) 31
2.8.1 25OX DenhardV s Reagenz 3
2 8.2 Natriumphosphatpuffer:
2.8.3 20XSSC: 3I
2.8.4 Vorhybridisierungslösung (stnngent): 32
2 8.5 Hybridisierungslösung(stringent): 32
2 8.6 Waschpuffer 32
3 METHODEN 33
J.1 Zdlkuttur-MethodeB 3J
3 1.1 Kultivierung von Zellen in Gewebekultur 33
3 1 2 Einfrieren und Auftauen von Zellkulturen 33
3.1.3 Geneticin- Konzentrationsbestimmung für die Zellhybridselektion 34
3.2 Miknnett-vennhtcittr EiazekhroimMomen-Transfer 34
3.2.1 Aussäen der Donor/ellen 34
3.2.2 Aussäen der Empfängerzellen 35
3.2.3 Herstellung der Mikrozellen 35
3 2 4 Mikrozell-Zellfusion 37
3 2.5SelelttionderHybndzellenmitG418undHAT 37
3.2.6 FusionskontroUen W
3.2.7 fGonwachstumsbeobachtungen in der frühen Seleküonsphase 39
3 2.8 Klonierung mit Klonierungsringen und 3MM-Plättchen 39
3.2.9 Expansion der Zeilklone 40
33 DNA-Prlpantio. 41
3-3.1 Extraktion genomischer DNA aus Zellkulturen 41
3.3.2 DNA-Prazipilaüon 41
3 3 3 Vermessen der DNA 42
3.3.3.1 Pfaotometnschc DNA-KonzemraUonsbeaimmung 42
3.3.3.2 DNA-Vermessung durch Elektrophorese im Agarose-Horizomaige! mit Ethidiumbromid 42
3.3.4 Markonuig von DNA-Sonden (Random-Prumrig mi! i2P dCTP) 43
Inhaltsverzeichnis
3.4 Mikrosatelliten-PCR (Dinucleotid-Repeat-PCR) 44
3.4.1 Radioaktive Primer-Maikierung 44
3.4.2 Durchführung der PCR 45
3.5 Elektrophorese-Techniken 46
3.5.1 Elektrophorese von DNA in Polyacrv lamid-Hamstoff-Vertikalgelen 46
3.5.2 DNA-Elektrophorese in Agarose-Horizomalgelen 47
3.5.3 DNA-Transfer auf Gene ScreenPlus™ Membran (Southern Blot) 48
3.6 Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung 49
3.6.1 Metaphasenpräparation 49
3.6.2 Auftropfen der Metaphasen 49
3.6.3 Hybridisierung 50
3.6.4 Detektion 50
3.6.5 Auswertung der Metaphasen 51
3.7 weitere DNA-Transfertechniken 52
3.7 1 DNA-Transfer auf Nitrozellulose-Membran (Slot-BIot) 52
3.8 Hvbridisierung von Southera-Fütern 52
3.8.1 DNA-DNA Hybridisierungen 52
3.9 Statistische Berechnungen 53
4 ERGEBNISSE 54
4.1 Fusionen 54
4.1.1 Mikrozell-vermittelter Einzelchromosomen-Transfer (MMCT) 54
4.1.1.1 HeLa-Fusionen 54
4 1.1 2 HPK Il-Fusionen 55
4 1.1.3C33A-Fusionen 55
4.2 Wachstumseigenschaften der Hybridzellen 56
4.2.1 Wachstumsverhalten in der frühen Selektionsphase 56
4.2.1.1 Statistische Tabellen 57
4.2 1.1.1 Zellinie = HeLa 57
4 2 1 I 2 Zellinie = HPK II 58
4.2.1 2 Zusammenfassung und Auswertung der Tabellen und der Statistik 61
4.2 2 Wachstumsverhalten der gepickten Klone 62
4.2.2.1 Fusionsübersichtstabellen 63
4.2 2.1.1 Tab.7: HeLa-Fusionen 63
4.2.2.1.2 Tab.8: HPK «-Fusionen 64
4.2 2 1.3 Tab.». C33A-Fusionen 65
4 2.2 2 Wachstumskurven 66
4 2.2.3 Wachstumsauflällige Klone 69
4.3 Charakterisierung der Klone 71
43 1 Mikrosatelliten-PCR (Dinucleotid-Repeat-PCR) 71
4 3 11 HeLa-Hybride mit Chr. 4 71
43111 Tab 11: Nachweis des Donor-Chromosom 4 in HeLa-Hybriden 74
4 3.!2HPKH-undC33A-fhtridemitChr4 76
4.3
4.3.
4.3.
4.3.
4.3.
.2.1 Tab 12: Nachweis des Donor-Chromosoms 4 in HPK U-Hybriden 77
.2.2 Tab 13: Nachweis des Donor-Chromosoms 4 in C33A-Hvbriden 77
4 3.1 3 HeLa-. HPK 11- und C33A-Hvbride mit Chromosom 2Ü 78
.3 1 Tab 14: Nachweis von Donor-Chromosom 20 in HeLa-Hybriden 78
.3.2 Tab. 15: Nachweis von Donor-Chromosom 20 in HPK Il-Hybriden 78
3.3 Tab 16: Nachweis von Donor-Chromosom 20 in C33A-Hvbriden 79
4.3.2 Southern Blots 79
Inhaltsverzeichnis
4.4.1 Tab.17: zytogenetische Merkmale ausgesuchter Hybride mit Donor-Chromos.4 81
4.5 Slot-BMs 84
5 DISKUSSION 86
6 ZUSAMMENFASSUNG 99
7 SUMMARY 100
8 ABKÜRZUNGEN 101
9 LITERATURLISTE 103
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