Isolierung, biochemische und immunologische Charakterisierung von Aminopeptidasen aus der menschlichen Niere: Differenzierung von Isoformen der Aminopeptidase A (Angiotensinase A, ATA) und Aminopeptidase M (APM)
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1998
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1
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
VORWORT
4
1.
EINLEITUNG
6
1.1.
ZIRKULIERENDE
UND
LOKALE
RENIN-ANGIOTENSIN-SYSTEME
6
1.1.1.
DAS
LOKALE
RENIN-ANGIOTENSIN-SYSTEM
DER
NIERE
9
1.2.
WIRKUNGEN
VON
ANGIOTENSIN
II
(ANG
II)
IN
DER
NIERE
.10
1.3.
ANGIOTENSINASE
A
(AMINOPEPTIDASE
A)
.17
1.4.
AMINOPEPTIDASE
M
(APM)
.19
1.5.
MOEGLICHE
PATHOPHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNGEN
DER
ATA
.19
1.6.
SPEZIFISCHE
AUFGABENSTELLUNG
.20
2.
ABKUERZUNGEN
.21
3.
MATERIAL
.23
3.1.
ALLGEMEINE
LABORGERAETE
UND
ZUBEHOER
.23
3.1.1.
SAEULENCHROMATOGRAPHIE-UND
ELEKTROPHORESEAUSRUESTUNG
.24
3.1.2.
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
FUER
ZELLKULTUR
.24
3.2.
ALLGEMEINE
REAGENZIEN
UND
CHEMIKALIEN
.25
3.2.1.
CHROMATOGRAPHIE-UND
ELEKTROPHORESEGELE
.25
3.2.2.
PUFFER
UND
ZELLKULTURMEDIEN
.25
3.2.3. SUBSTRATE
UND
ANTISEREN
.26
3.2.4.
ORGANGEWEBE
UND
VERSUCHSTIERE
.27
4.
METHODEN
.28
4.1.
ISOLIERUNG
VON
AMINOPEPTIDASEN
AUS
GLOMERULI
.28
4.1.1.
GLOMERULIISOLIERUNG
MITTELS
DIFFERENTIAISIEBTECHNIK
.29
4.1.2.
SOLUBILISATION
VON
BUERSTENSAUMENZYMEN
MIT
BROMELAIN
.30
4.1.3.
KONVENTIONELLE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.30
4.2.
REINIGUNG
VON
AMINOPEPTIDASEN
AUS
NIERENRINDE
.30
4.2.1.
GEWEBEAUFSCHLUSS
UND
SOLUBILISATION
.30
4.2.2.
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFAT-PRAEZIPITATION
.31
4.2.3.
AUFREINIGUNG
MITTELS
FPLC-SYSTEM
.32
4.2.4.
PRAEPARATIVE
NATIV-PAGE
.32
2
4.3.
ENZYMAKTIVITAETSNACHWEISE
.33
4.3.1.
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAET
VON
ATA,
APM,
DAP
IV
UND
YGT
.33
4.3.1.1.
MANUELLE
ENZYMMESSUNG
AM
PHOTOMETER
ZEISS
PM
4
.34
4.3.1.2.
ENZYMBESTIMMUNG
AM
ANALYSENAUTOMATEN
.34
4.3.1.3.
ENZYMBESTIMMUNG
IN
DER
MIKROTITRATIONSPLATTE
MIT
EUSA-READER
.34
4.3.2.
ENZYMFAERBUNGEN
.34
4.3.2.1.
ENZYMNACHWEIS
AUF
GEFRIERSCHNITTEN
.35
4.3.2.2.
ENZYMNACHWEIS
IN
ELEKTROPHORESE
UND
DIFFUSIONSGELEN
.35
4.4.
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
VON
LOESUNGEN
.36
4.4.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
UV-ABSORPTION
BEI
280
NM
.36
4.4.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
.36
4.4.3.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.37
4.4.4.
PROTEINBESTIMMUNG
MIT
DER
BCA-METHODE
.37
4.5.
ANALYTISCHE
ELEKTROPHORESETECHNIKEN
AUF
DEM
PHASTYY-SYSTEM
.37
4.5.1.
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDPROTEINE
.38
4.5.2.
NATIVE
UND
SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
(PAGE)
.39
4.5.3.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.39
4.5.4.
TITRATIONSKURVENANALYSE
.39
4.5.5.
ZWEIDIMENSIONALE
ELEKTROPHORESE
.40
4.5.6.
PRAEPARATIVE
ELEKTROPHORESE
(NATIV-PAGE)
.40
4.6.
FAERBUNG
DER
ELEKTROPHORESEGELE
.41
4.6.1.
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
.41
4.6.2.
SILBERFAERBUNG
IM
PHASTYY-SYSTEM
.41
4.7.
KONVENTIONELLE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.41
4.7.1.
GELFILTRATION
AN
SEPHADEX
G-50
.41
4.7.2.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
WGA-AGAROSE
.41
4.7.3.
GELFILTRATION
MIT
SEPHACRYL
S-300
.42
4.8.
COMPUTERKONTROLLIERTE
CHROMATOGRAPHIE
MITTELS
FPLC-SYSTEM
.
.43
4.8.1.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE
(HIC)
.43
MIT
PHENYL-SUPEROSE
UND
PHENYL-SEPHAROSE
CL4B
4.8.2.
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
MIT
MONO-Q
.44
UND
Q-SEPHAROSE
FASTFLOW
4.8.3.
CHROMATOFOKUSSIERUNG
AN
MONO-P
.46
4.8.4.
GELFILTRATION
MIT
SUPEROSE
12
.46
3
4.9.
ENTSALZUNG,
KONZENTRIERUNG
UND
STERILFILTRATION
VON
PROTEINEN
.48
4.9.1.
SCHLAUCHDIALYSE
MIT
PUFFERWECHSEL
.48
4.9.2.
KONZENTRIERUNG
IM
DIALYSESCHLAUCH
MIT
AQUACIDE
I
.48
4.9.3.
KONZENTRIERUNG
IM
DIALYSESCHLAUCH
UNTER
VAKUUM
.48
4.9.4.
KONZENTRIERUNG
MIT
TANGENTIALFLUSSSYSTEM
MINITAN
.48
4.9.5.
IMMERSIBLE
CX-ULTRAFILTRATION
.49
4.9.6.
CENTRIPREP-UITRAFILTRATION
.49
4.9.7.
ENTSALZUNG
MIT
PD-10
SAEULEN
.49
4.9.8.
STERILFILTRATION
VON
PROTEIN
UND
PUFFERLOESUNGEN
.49
4.10.
PRODUKTION
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
.50
4.10.1.
IMMUNISIERUNGEN
VON
KANINCHEN
.50
4.10.2.
ISOLIERUNG
DER
IGG-FRAKTION
.51
4.11.
PRODUKTION
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
(MAK)
.51
4.11.1.
THEORETISCHE
GRUNDLAGEN
DER
SOMATISCHEN
ZELLHYBRIDISIERUNG
.51
4.11.2.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
.52
4.11.3.
SELEKTION
DER
X63-AG.8-MYELOMZELLEN
MIT
8-AZAGUANIN
.53
4.11.4.
PRAEPARATION
VON
PERITONEALMAKROPHAGEN
ALS
"
FEEDER"-ZELLEN
.53
4.11.5.
SOMATISCHE
ZELLHYBRIDISIERUNG
.54
4.11.6.
HAT-SELEKTION
DER
FUSIONSPRODUKTE
.55
4.11.7.
WACHSTUM
UND
KLONIERUNG
DER
ZELLEN
.55
4.11.8.
EXPANSION
DER
AK-PRODUZIERENDEN
HYBRIDOMZELLEN
.56
4.11.9.
KRYOKONSERVIERUNG
VON
HYBRIDOMZELLEN
.56
4.12.
IMMUNDOPPELDIFFUSION
[OUCHTERIONY,
1968]
.56
4.13.
IMMUNHISTOLOGIE
AUF
KRYOSCHNITTEN
.57
4.13.1.
GEFRIEREINBETTUNG
VON
FRISCHGEWEBEN
.57
4.13.2.
PRAEPARATION
VON
KRYOSCHNITTEN
.57
4.13.3.
IMMUNHISTOLOGIE
MIT
DER
INDIREKTEN
POD-REAKTION
.58
4.13.4.
GEGENFAERBUNG
VON
KRYOSTATSCHNITTEN
.59
4.13.5.
KONSERVIERUNG
UND
DOKUMENTATION
VON
KRYOSTATSCHNITTEN
.59
4.14.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
AUF
KRYOSTATSCHNITTEN
.60
4.15.
IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG
VON
LYMPHOZYTEN
.60
4.16.
SEMI-DRY
IMMUNOBLOT
("WESTEMBLOT")
MIT
PHASTTRANSFERYY
.61
4
5.
ERGEBNISSE
.62
5.1.
ATA
UND
APM
AUS
GLOMERULI
.62
5.2.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
GEGEN
ATA
AUS
GLOMERULI
.65
5.3.
ATA-TEOFORMEN
UND
APM
AUS
GESAMTNIERE
.67
5.3.1.
VORVERSUCHE
ZUR
ETABLIERUNG
DES
REINIGUNGSSCHEMAS
.67
5.3.1.1.
ATA-PRAEPARATION
AUS
NIERENRINDENHOMOGENAT
.72
5.3.1.2.
APM-PRAEPARATION
AUS
NIERENRINDENHOMOGENAT
.77
5.3.2.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
ATA
UND
APM
.80
5.3.3. HISTOCHEMIE
AUF
KRYO-SCHNITTEN
DER
HUMANNIERE
.85
5.3.4.
REINIGUNG
DER
POLYKLONALEN
ANTIKOERPER
.87
5.3.5.
IMMUNHISTOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
ATA
UND
APM
.88
5.3.5.1.
INDIREKTE
PEROXIDASE-TECHNIK
.88
5.3.S.2.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZTECHNIK
.91
5.3.6.
IMMUNOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.95
5.3.6.1.
IMMUNDOPPELDIFFUSION
NACH
OUCHTERIONY
.95
S.3.6.2.
SEMI-DRY
IMMUNOBLOT
("WESTEMBLOT")
.97
5.3.6.3.
IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG
VON
LYMPHOZYTEN
.100
6.
DISKUSSION
.101
6.1.
METHODEN
.101
6.2.
ISOLIERUNG
VON
APA
(ATA)
AUS
GLOMERULI
.101
6.3.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.102
6.4. APA-ISOLIERUNG
AUS
NIERENRINDENHOMOGENAT
.102
6.4.1.
ERGEBNISSE
ANDERER
ARBEITSGRUPPEN
.104
6.5.
ISOLIERUNG
DER
APM
.107
6.5.1.
ERGEBNISSE
ANDERER
ARBEITSGRUPPEN
.108
6.6.
NEUERE
ENTWICKLUNGEN
.109
6.7.
AUSBLICK
.113
7.
ZUSAMMENFASSUNG
.114
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.116
8.1.
BISHERIGE
PUBLIKATIONEN
VON
ERGEBNISSEN
DIESER
ARBEIT
.131
9.
DANKSAGUNG
.132
10.
CURRICULUM
VITAE
.133
11.
EHRENWOERTLICHE
ERKLAERUNG
.134 |
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