Untersuchungen zur FSH-abhängigen Genexpression in Sertoli-Zellen mit cDNA-Arrays anhand des Modells eines konstitutiv aktiven FSH-Rezeptors:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG. 1
1.1 FORTPFLANZUNG. 1
1.2 KEIMZELLREIFUNG (GAMETOGENESE). 1
1.3 HORMONELLE REGULATION DER KEIMZELLREIFUNG. 3
1.3.1 HORMONELLE REGULATION DER SPERMATOGENESE. 4
1.4 DIE BEDEUTUNG VON FSH FUER DIE SPERMATOGENESE. 6
1.4.1 DIE BEDEUTUNG VON FSH FUER INITIIERUNG DER SPERMATOGENESE. 6
1.4.2 DIE BEDEUTUNG VON FSH FUER DIE AUFRECHTERHALTUNG
DER SPERMATOGENESE. 7
1.5 DIE SERTOLI-ZELLE.). 8
1.5.1 FUNKTION UND AUFGABE DER SERTOLI-ZELLE. 8
1.5.2 DAS MODELL DER SERTOLI-ZELLLINIE SK-11. 9
1.6 DER FSH-REZEPTOR. 10
1.6.1 STRUKTUR UND GENOMISCHE ORGANISATION DES FSH-REZEPTORS. 10
1.6.2 SIGNALTRANSDUKTION DES FSH-REZEPTORS. 12
1.6.3 MUTATIONEN DES FSH-REZEPTORS. 13
1.7 GENEXPRESSIONSANALYSE MIT CDNA-ARRAYS. 16
1.7.1 AUFBAU VON CDNA-ARRAYS. 16
1.7.2 FUNKTIONSPRINZIP VON CDNA-ARRAYS. 17
*
2 ZIELE DER ARBEIT.22
3 MATERIAL UND METHODEN. 23
3.1 GEWINNUNG UND AUFBEWAHRUNG VON GEWEBEPROBEN. 23
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN. 23
3.2.1 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN. 23
3.2.1.1 DNA-ISOLIERUNG. 23
3.2.1.2 RNA-ISOLIERUNG (GESAMT-RNA). 24
3.2.1.3 MRNA-ISOLIERUNG. 25
3.2.2 ELEKTROPHORESETECHNIKEN. 26
3.2.2.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE. 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
_N
3.2.22
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 27
3.2.3 DNA-AUFREINIGUNG AUS AGAROSE-GELEN. 27
3.2.4 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN. 28
3.2.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) -BASIERTE TECHNIKEN. 28
3.2.5.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 28
3.2.5.2 REVERSE-TRANSKRIPTIONS-POLYMERASE-KETTENREAKTION. 30
3.2.5.3 NESTED POLYMERASE-KETTENREAKTION (NESTED-PCR). 30
3.2.6 SEQUENZIERUNGEN. 31
3.2.6.1 SANGER-SEQUENZIERUNG. 32
3.2.6.2 SEQUENZVERGLEICHE. 33
3.2.7 GENEXPRESSIONSANALYSE MIT CDNA-ARRAYS. 33
3.2.7.1 MARKIERUNG DER PROBEN MIT [A
32P] DATP. 34
3.2.7.2 SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DER
MARKIERTEN PROBEN. 35
32.1.3
BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DER MARKIERTEN PROBEN. 35
3.2.7.4 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION. 35
3.2.7.5 AUSWERTUNG DER CDNA-ARRAYS. 36
3.2.7.6 YYSTRIPPING" DER CDNA-ARRAYS. 37
3.2.8 NORTHERN BLOTTING. 37
3.2.8.1 RNA-GELELEKTROPHORESE. 37
3.2.8.2 TRANSFER DER RNA. 38
3.2.8.3 FIXIERUNG DER RNA AUF DEM BLOT. 38
3.2.9 HERSTELLUNG DER SONDEN FUER DIE NORTHERN BLOT-ANALYSE. 38
3.2.9.1 GENERIERUNG VON GENSPEZIFISCHEN CDNA-FRAGMENTEN. 38
3.2.9.2 KLONIERUNGEN. 39
3.2.9.2.1 LIGATION.
'. 39
3.2.9.2.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN. 40
3.2.9.2.3 TRANSFORMATION. 40
3.2.9.2.4 PCR-SCREENING DER TRANSFORMIERTEN KLONE. 41
3.2.9.2.5 MINI-PLASMIDISOLIERUNGEN. 41
3.2.9.2.6 RESTRIKTIONSVERDAU. 42
3.2.9.3 MARKIERUNG DER CDNA SONDEN MIT [A
32P] DATP. 42
3.2.9.4 BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DER CDNA-SONDEN. 43
3.2.9.5 HYBRIDISIERUNG. 43
INHALTSVERZEICHNIS_DI
3.2.9.6 AUSWERTUNG DER NORTHERN BLOTS. 43
12.9.1
YYSTRIPPING" DER HYBRIDISIERTEN MEMBRAN. 44
3.3 ZELLKULTURARBEITEN. 44
3.3.1 KULTIVIERUNG DER ZELLLINIEN. 44
3.3.2 KRYOKONSERVIERUNG. 45
V
3.3.3 BESTIMMUNG DER FSH-REZEPTORZAHL UND -BINDUNGSAFFINITAET. 45
3.3.4 BESTIMMUNG DER BASALEN CAMP-SPIEGEL IN WT UND MUT ZELLEN. 46
3.3.5 STIMULATIONSVERSUCHE MIT FSH. 46
3.4 IMMUNOASSAY. 46
3.4.1 CAMP-ELISA. 46
3.5 STATISTIK. 48
3.6 LOESUNGEN. 48
3.7 MATERIALIEN UND GERAETE. 52
3.7.1 MATERIALIEN. 52
3.7.1.1 CHEMIKALIEN. 52
3.7.1.2 PLASMIDVEKTOREN UND BAKTERIENSTAEMME. 52
3.7.1.3 LAENGENMARKER. 52
3.7.1.4 PRIMER. 53
3.7.2 GERAETE. 54
4 ERGEBNISSE. 55
4.1 ARBEITSVERLAUF.!. 55
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER ZELLLINIEN WT UND MUT. 56
4.2.1 SEQUENZIERUNG DES FSH-REZEPTORS IN WT UND MUT ZELLEN. 56
4.2.1.1 VERGLEICH DER SEQUENZEN. 57
4.2.2 CAMP-PRODUKTION DER ZELLLINIEN WT UND MUT. 58
4.2.2.1 DOSISABHAENGIGE CAMP-PRODUKTION NACH FSH-STIMULATION. 58
4.2.2.2 BASALE CAMP-PRODUKTION DER ZELLLINIEN WT UND MUT. 59
4.2.2.3 CAMP-PRODUKTION NACH FSH-STIMULATIONEN BEI
KULTIVIERUNGSTEMPERATUREN VON 33C UND 39,5C. 60
4.2.4 BINDUNGSCHARAKTERISTIK DER ZELLLINIEN WT UND MUT. 61
4.3 GENEXPRESSIONSANALYSE DER ZELLLINIEN WT UND MUT MIT CDNA-ARRAYS. 61
4.3.1 IDENTIFIZIERUNG VON GENEN IN DEN ZELLLINIEN WT UND MUT. 62
4.3.2 QUANTIFIZIERUNG DER GENEXPRESSION IN DEN ZELLLINIEN WT UND MUT.
62
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.3.3 EINFLUSS DER KULTIVIERUNGSTEMPERATUR AUF DIE GENEXPRESSION. 63
4.3.4 IDENTIFIZIERUNG DIFFERENZIELL EXPRIMIERTER GENE. 64
4.3.5 ANALYSE DER ERGEBNISSE / LITERATURVERGLEICH. 66
4.4 UEBERPRUEFUNG DER CDNA-ARRAY ERGEBNISSE MIT NORTHERN BLOTS. 68
4.5
IN VIVO EXPRESSION VON KANDIDATENGENEN. 72
4.5.1 NORTHERN BLOT ANALYSE DER
IN VIVO EXPRESSION VON KANDIDATENGENEN
IM HODEN. 72
4.6 APPENDIX: LISTE DER MIT CDNA-ARRAYS IN DEN SERTOLI-ZELLINIEN
WT UND MUT DETEKTIERTEN GENE. 74
5 DISKUSSION. 79
5.1 SERTOLI-ZELLINIEN ALS MODELL ZUM STUDIUM VON FSH-WIRKUNGEN. 79
5.2 HINTERGRUND DES ZELLKULTURMODELLS WT UND MUT. 80
5.3 UNTERSCHEIDUNG DER TRANSFIZIERTEN FSH-REZEPTORVARIANTEN. 80
5.4 FUNKTIONELLE UNTERSCHIEDE DER ZELLINIEN WT UND MUT. 81
5.4.1 EINFLUSS DER KULTIVIERUNGSTEMPERATUR AUF DIE FUNKTIONELLEN
EIGENSCHAFTEN DER ZELLINIEN WT UND MUT. 84
5.5 DER EINSATZ VON CDNA-ARRAYS ZUR ANALYSE DIFFERENZIELLER
GENEXPRESSION. 85
5.5.1 GENEXPRESSIONSPROFILE DER ZELLLINIEN WT UND MUT. 86
5.2.2 EINFLUSS DER KULTIVIERUNGSTEMPERATUR AUF DIE GENEXPRESSION. 87
5.5.3 EINFLUSS DER AKTIVIERENDEN FSH-REZEPTORMUTATION AUF DIE REGULATION
DER GENEXPRESSION. 88
5.6 BESTAETIGUNG DER CDNA-ARRAY ERGEBNISSE MIT NORTHERN BLOTS. 89
5.7 FSH-WIRKUNGEN IN DER SERTOLI-ZELLE. 91
5.8 EXPRESSION FSH-REGULIERTER GENE IM LAUFE DER HODENENTWICKLUNG. 94
5.9 AUSBLICK.
'. 96
6 ZUSAMMENFASSUNG. 97
7 LITERATURVERZEICHNIS. 98
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS,
109
INHALTSVERZEICHNIS
V
9 SCHRIFTENVERZEICHNIS. 113
9.1 VORTRAEGE UND POSTER MIT PUBLIZIERTEM ABSTRACT. 113
9.2 ORIGINALARBEITEN. 113
10 DANKSAGUNG. 115
11 LEBENSLAUF.
116 |
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