Molekularbiologische Untersuchungen zur Gibberellin- und Pigment-Biosynthese bei Gibberella fujikuroi unter besonderer Berücksichtigung der Optimierung der Gibberellinproduktion:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS.I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.VI
1 EINLEITUNG.1
1.1 DIE BIOTECHNOLOGISCHE NUTZUNG DER PILZE.1
1
.2 GIBBERELLA FUJIKUROI.4
1.2.1 DIE GIBBERELLIN-BIOSYNTHESE.7
1.2.2 DIE CAROTINOID-BIOSYNTHESE.12
1.2.3 DIE BIKAVERIN-BIOSYNTHESE.16
1.2.4 MOEGLICHKEITEN ZUR OPTIMIERUNG DER GIBBERELLINPRODUKTION MIT
MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODEN.18
1.3 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.21
2 MATERIAL UND METHODEN.22
2.1 STAEMME UND KULTURBEDINGUNGEN.22
2.2 PLASMIDE.23
2.3 PRIMER.23
2.3.1 SEQUENZIERUNGS-PRIMER. 23
2.3.2 PCR-PRIMER.24
2.4 CHEMIKALIEN.24
2.5 HAEUFIG VERWENDETE PUFFER UND LOESUNGEN.25
2.6 MEDIEN. 26
2.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN.27
2.7.1 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN.27
2.7.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI.27
2.7.1.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS LAMBDA-PHAGEN.27
2.7.1.3 ISOLIERUNG DER GESAMT-DNA VON
G. FUJIKUROI.28
2.7.1.4 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS
G. FUJIKUROI.28
2.7.2 GELELEKTROPHORESE UND RESTRIKTION VON NUCLEINSAEUREN.29
2.7.2.1 DNA-RESTRIKTION.29
2.1.22
DNA-GELELEKTROPHORESE.29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/961137789
II
2.7.2.3 RNA-GELELEKTROPHORESE. 29
2.7.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.29
2.7.4 TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN AUF MEMBRANEN.30
2.7.4.1 TRANSFER VON DNA AUF MEMBRANEN.30
2.7.4.2 TRANSFER VON RNA AUF MEMBRANEN.30
2.7.5 SCREENING DER CHROMOSOMALEN EMBL3-GENBANK VON
G. FUJIKUROI.30
2.7.6 HYBRIDISIERUNGEN.
).30
2.7.6.1 MARKIERUNG VON DNA.30
2.1.62
DNA-DNA-HYBRIDISIERUNGEN.31
2.7.6.3 RNA-DNA-HYBRIDISIERUNGEN .31
2.7.7 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.31
2.7.8 DNA-SEQUENZIERUNG.32
2.7.9 TRANSFORMATION VON
G. FUJIKUROI.77.32
2.7.9.1 HERSTELLUNG VON PROTOPLASTEN.32
2.7.9.2 TRANSFORMATION.33
2.1.93
GENETISCHE REINDARSTELLUNG DER TRANSFORMANTEN.33
2.7.10 PCR.34
2.7.10.1 PCR MIT GENOMISCHER DNA.34
2.7.10.2 RT-PCR.34
2.8 GIBBERELLIN-BESTIMMUNGEN.35
2.8.1 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE.35
2.8.2 HPLC-ANALYSE.
V. 35
2.8.3 GC-MS-ANALYSE.36
2.9 PHYTOENBESTIMMUNG.37
3 ERGEBNISSE.*.38
3.1 CHARAKTERISIERUNG DER GIBBERELLIN-BIOSYNTHESE BEI DEN VERWENDETEN
G. FUJIKUROI
STAEMMEN.39
3.1.1 UNTERSUCHUNG DES GIBBERELLINSPEKTRUMS BEI STAMM IMI58289.39
3.1.2 VERGLEICH DER GA
3
-BILDUNG DER STAEMME M567 UND IMI58289 IN EINEM
SYNTHETISCHEN UND EINEM KOMPLEXEN KULTURMEDIUM.40
3.1.3 VERGLEICH DER EXPRESSION VON DREI GENEN DER
GIBBERELLIN-BIOSYNTHESE BEI
M567 UND IMI58289.42
3.1.4 VERGLEICH DER ORGANISATION DER GIBBERELLIN-SYNTHESEGENE BEI M567
UND
IMI58289.44
III
3.2 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES PHYTOENSYNTHASE-KODIERENDEN
GENS
CARRA
VON
G. FUJIKUROI.46
3.2.1 ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON
CARRA.46
3.2.2 STRUKTURANALYSE DES CARIL4-GENS.48
3.2.3 AUSSCHALTUNG DER CAROTINOID-BIOSYNTHESE.55
3.2.3.1 KONSTRUKTION DES YYGENE-REPLACEMENT"-VEKTORS.55
3.2.3.2 TRANSFORMATION VON
G. FUJIKUROI ZUR AUSSCHALTUNG DER CAROTINOID-
BIOSYNTHESE .56
3.2.4 EINFLUSS DER AUSSCHALTUNG DES CAR.&4-GENS AUF DIE
GIBBERELLINPRODUKTION.60
3.3 ISOLIERUNG DES AN DER BIKAVERIN-BIOSYNTHESE BEI
G. FUJIKUROI BETEILIGTEN
POLYKETIDSYNTHASE-GENS.61
3.3.1 ISOLIERUNG VON GENEN MIT HOMOLOGIE ZU POLYKETIDSYNTHASE-GENEN.61
3.3.1.1 KLONIERUNG VON
PKSL.'.62
3.3.1.2 KLONIERUNG VON
PKS2.63
3.3.1.3 KLONIERUNG VON
PKS3.65
3.3.1.4 VERSUCH DER AUSSCHALTUNG DER BIKAVERIN-BIOSYNTHESE DURCH
INAKTIVIERUNG VON
PKSL UND PKS3.66
3.3.2 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
PKS4.67
3.3.2.1 AUSSCHALTUNG VON
PKS4.67
3.3.2.2 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON
PKS4.70
3.3.2.3 STRUKTURANALYSE VON
PKS4.71
3.3.2.4 VERGLEICH DES
PKS4-GENS VON G. FUJIKUROI MIT PKS-GENEN ANDERER
FILAMENTOESER PILZE.76
3.3.2.5 VERGLEICH VON
PKS4 MIT DEN DREI WEITEREN POTENTIELLEN PKS-GENEN
VON
G. FUJIKUROI.78
3.3.2.6 UNTERSUCHUNG DER GIBBERELLIN-PRODUKTION DER P^-AUSSCHALT
MUTANTEN IM VERGLEICH ZUM
G. FUJIKUROI AUSGANGSSTAMM.79
3.4. ERHOEHUNG DER KOPIEZAHL DER GIBBERELLIN-SYNTHESEGENE GGS2 UND
CPS/KS.80
3.4.1 VEKTORKONSTRUKTION.80
3.4.2 ERGEBNIS DER TRANSFORMATIONEN MIT PGKS BZW. PGKSCOS.83
3.4.3 UNTERSUCHUNG DER GIBBERELLIN-PRODUKTION DER TRANSFORMANTEN.85
3.5 TRANSFORMATION VON
G. FUJIKUROI MIT DEM GIBBERELLIN-GENCLUSTER.87
3.5.1 KONSTRUKTION EINER COSMID-GENBANK VON
G. FUJIKUROI.87
3.5.2 ISOLIERUNG VON COSMIDEN, DIE GIBBERELLIN-SYNTHESEGENE ENTHALTEN.88
3.5.3 CHARAKTERISIERUNG DER ISOLIERTEN COSMIDE.89
IV
3.5.4 TRANSFORMATION VON
G. FUJIKUROI MIT DEN COSMIDEN.91
3.5.5 UNTERSUCHUNG DER VEKTORINTEGRATION.92
3.5.6 UNTERSUCHUNG DER GIBBERELLINPRODUKTION DER TRANSFORMANTEN.95
3.6 STOFFWECHSEL-DESIGN: VERGLEICH ZWISCHEN KLASSISCHER MUTAGENESE UND
YYGENE-DISRUPTION" AM BEISPIEL DER KONSTRUKTION EINES GA
7
-PRODUKTIONS-
STAMMES VON
G. FUJIKUROI.97
3.6.1 CHARAKTERISIERUNG DES GA
7
-PRODUKTIONSSTAMMES 6314.97
3.6.2 ERZEUGUNG EINES GA
7
-PRODUKTIONSSTAMMES DURCH YYGENE-DISRUPTION".99
3.6.3 VERGLEICH DER GIBBERELLINPRODUKTION DER
G. FUJIKUROI STAEMME M567, 6314
UND P3-2.101
4 DISKUSSION.103
4.1 DAS
CARRA-GE N VON G. FUJIKUROI.104
4.1.1 PROMOTORANALYSE.105
4.1.2 VERGLEICH VON
CARRA MIT PHYTOENSYNTHASE-GENEN ANDERER TAXA.109
4.1.3 CHARAKTERISIERUNG DER PHYTOENSYNTHASE-GENE VON PILZEN.111
4.2 ISOLIERUNG VON PKS-GENEN BEI
G. FUJIKUROI.114
4.3 DAS
PKS4-GEN VON G. FUJIKUROI.115
4.3.1 PROMOTORANALYSE.115
4.3.2 VERGLEICH VON
PKS4 MIT ANDEREN PKS-GENEN FILAMENTOESER PILZE.118
4.4 DER EINFLUSS GENTECHNISCHER MASSNAHMEN AUF DIE
GIBBERELLINPRODUKTION.121
4.4.1 OPTIMIERUNG DER GIBBERELLIN-BIOSYNTHESE DURCH EINE VERBESSERTE
BEREITSTELLUNG VON VORSTUFEN. 122
4.4.1.1 AUSSCHALTUNG DER CAROTINOID-BIOSYNTHESE.122
4.4.1.2 AUSSCHALTUNG DER BIKAVERIN-BIOSYNTHESE.
.125
/
4.4.1.3 WEITERE MOEGLICHKEITEN ZUR OPTIMIERUNG DER VERSORGUNG MIT
VORSTUFEN.126
4.4.2 DIE AMPLIFIZIERUNG VON GIBBERELLIN-SYNTHESEGENEN UND WEITERE
PERSPEKTIVEN ZUR OPTIMIERUNG DER GIBBERELLINPRODUKTION.127
4.4.3 STOFFWECHSEL-DESIGN.133
5 ZUSAMMENFASSUNG
135
6 LITERATUR.136
7 ANHANG.148
DANKSAGUNG.154
LEBENSLAUF.155 |
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