Die Strukturgenregion (Kapsid, Erns, E1 und E2) des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV): Expression und Immunisierung mit rekombinanten Sindbisvirus- und cDNA-Vektoren
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
SCHRIFTTUM
2
2.1
DIE
FAMILIE
DER
FLAVIVIRIDAE
2
2.2
AUFBAU
DER
PESTIVIREN
5
2.2.1
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DER
NICHT
CODIERENDEN
REGIONEN
IM
BVDV-GENOM
8
2.2.2
DIE
STRUKTURPROTEINE
DER
PESTIVIREN
9
DAS
KAPSIDPROTEIN
C
(PL4)
9
DAS
GLYKOPROTEIN
EYY
(GP48
,
EO)
9
DAS
HUELLPROTEIN
EL
(GP25)
10
DAS
HUELLPROTEIN
E2
(GP
5
3)
10
2.23
DIE
NICHTSTRUKTURPROTEINE
DER
PESTIVIREN
12
DIE
AUTOPROTEASE
NPRO
(P20)
12
DAS
NICHTSTRUKTURPROTEINP7
12
DAS
NICHTSTRUKTURPROTEIN
NS2/3
(P!25)
12
DAS
NICHTSTRUKTURPROTEIN
NS4A
(PLO)
14
DAS
NICHTSTRUKTURPROTEIN
NS4B
(P38)
14
DAS
NICHTSTRUKTURPROTEIN
NS5A
(P58)
14
DAS
NICHTSTRUKTURPROTEIN
NS5B
(P75)
14
23
DER
REPLIKATIONSZYKLUS
VON
BVD-VIREN
15
3
MATERIAL
UND METHODEN
18
3.1
ZELLKULTUREN
18
3.1.1
BOVINE
EMBRYONALE
LUNGENFIBROBLASTEN
(BEL)
18
3.1.2
BABY
HAMSTER
KIDNEY-ZELLEN
(BHK-21)
18
3.13
RABBIT
KIDNEY-ZELLEN
(RK
13
)
19
3.1.4
VEROZELLEN
19
3.1.5
MADIN
DARBY
BOVINE
KIDNEY
ZELLEN
(MDBK)
19
3.1.6
BOVINE
TURBINATE-ZELLEN
(BT)
19
3.1.7
PORCINE
KIDNEY-ZELLEN
[PK(15)]
20
3.2
VIRUSSTAEMME
20
3.2.1
BVDV-PT810
20
322
BVDV-CS8644
20
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3
BVDV-MD1
20
3.2.4
SINDBISVIRUS-HR
20
3.2.5
VERMEHRUNG
UND
TITRATION
DER
VIREN
21
3.3
PLASMIDE
21
33.1
VEKTORPLASMIDE
21
3.3.1.1
DER
KLONIERUNGSVEKTORPCR
2.1
-TOPO
21
3.3.1.2
DIE
EXPRESSIONSPLASMIDEPSINREP5
UNDPSINHIS
23
3.3.1.3
DAS
EXPRESSIONSPLASMIDPSIN987
25
3.3.1.4
DER
EXPRESSIONSVEKTORPCDNA3.1/MYC-HIS
26
332
HELFERPLASMIDE
27
3.3.2.1
DH-EB
27
33.2.2
DH(26S)5'SIN
28
333
REKOMBINANTE
KONSTRUKTE
ALS
POSITIV
UND
NEGATIVKONTROLLEN
28
3.4
AMPLIFIKATION
VIRALER
GENE
30
3.4.1
ISOLIERUNG
VON
BVDV-RNA
30
3.4.2
AMPLIFIZIERUNG
DER
SEQUENZEN
IN
DER
RT-PCR
30
3.4.2.1
AUSWAHL
DER
PRIMER
30
3.4.2.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
UND
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
32
3.5
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
IN
DEN
PCR*2.1-TOPO-VEKTOR
34
3.5.1
AUFREINIGUNG
DES
PCR-PRODUKTS
34
3.5.2
KLONIERUNG
IN
DEN
PCR*
2.1-TOPO-VEKTOR
(TOPO
TA
CIONING*-REAKTION)
34
3.53
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
35
3.5.4
ANALYSE
DER
KLONIERUNG
35
3.5.4.1
PRAEPARATION
DER
PLASMID-DNA
AUS
DER
BAKTERIENKULTUR
35
3.5.4.2
RESTRIKTIONSANALYSE
36
3.5.5
AUFREINIGUNG
DER
PLASMID-DNA
36
3.5.6
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
37
3.5.7
SEQUENZIERUNG
DER
KLONE
37
3.6
KLONIERUNG
IN
DIE
EXPRESSIONSVEKTOREN
37
3.6.1
KLONIERUNG,
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
UND
AUFREINIGUNG
REKOMBINANTER
EXPRESSIONSVEKTOREN
37
3.6.2
TEST
DER
AUFGEREINIGTEN
CDNA-PLASMIDE
AUF
ENDOTOXINFREIHEIT
(LIMULUS
TEST)
38
INHALTSVERZEICHNIS
3.7
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
41
3.7.1
LINEARISIERUNG
UND
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
DER
SINDBISVEKTOREN
PSINREPS
UND
PSINHISB
41
3.7.2
TRANSFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION
41
3.73
VERMEHRUNG
DER
REKOMBINANTEN
SINDBISVIREN
42
3.7.4
TITRATION
REKOMBINANTER
SINDBISVIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
42
3.8
TRANSFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
MIT
CDNA-PLASMIDEN
44
3.9
ANALYSE
DER
PROTEINEXPRESSION
46
3.9.1
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
46
3.9.2
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
(IF-MIKROSKOPIE)
47
3.9.2.1
IF-FAERBUNG
INTRAZELLULAERER
ANTIGENE
47
3.9.2.2
IF-FAERBUNG
VON
OBEIFLAECHENANTIGENEN
47
3.93
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
FUER
DIE
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
48
3.9.3.1
IF-FAERBUNG
INTRAZELLULAERER
ANTIGENE
48
3.9.3.2
OBEIFLAECHEN/AERBUNG
48
3.9.4
ANALYSE
UND
AUSWERTUNG
DER
IF-GEFAERBTEN
ZELLEN
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
48
3.9.5
IMMUNPRAEZIPITATION
50
3.9.5.1
GEWINNUNG
DER
PROBEN
50
3.9.5.2
MARKIERUNG
VON
PROTEINEN
MIT
BIOTIN
UND
IMMUNPRAEZIPITATION
50
3.9.5.3
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
51
3.9.5.4
WESTERN
BLOTTING
UND
DETEKTION
VON
BVDV
PROTEINEN
52
3.9.6
FAERBUNG
SS-GALAKTOSIDASE-EXPRIMIERENDER
ZELLEN
MIT
X-GAL
53
3.10
TIERVERSUCHE
54
3.10.1
TIERGRUPPEN
54
3.10.2
IMMUNISIERUNG
54
3.103
PROBENENTNAHME,
BEARBEITUNG
UND
LAGERUNG
56
3.11
TESTSYSTEME
56
3.11.1
NACHWEIS
VON
BVDV-ANTIKOERPERN
IN
SEREN
MITTELS
SERUM
NEUTRALISATIONSTEST
(SNT)
56
3.113
NACHWEIS
NEUTRALISIERENDER
ANTIKOERPER
GEGEN
SINDBISVIRUS
IM
PLAQUEREDUKTIONSTEST
57
INHALTSVERZEICHNIS
4
ERGEBNISSE
58
4.1
KONSTRUKTION
DER
REKOMBINANTEN
KLONIERUNGSVEKTOREN
58
4.1.1
AMPLIFIKATION
DER
BVDV-GENE
58
4.1.2
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
IN
DEN
PCR*2.1-TOPO-VEKTOR
60
4.1.3
HERSTELLUNG
DER
KLONE
NPRO-E2PCR2.1
UND
NS3-NPRO-PCR
2.1
61
4.2
EXPRESSION
DER
BVDV-STRUKTURGENE
64
4.2.1
KLONIERUNG
IN
AUF
RNA-TRANSFEKTION
BASIERENDE
SINDBISVIRUS
EXPRESSIONSVEKTOREN
UND
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
IN
RNA
64
4.2.2
EXPRESSION
DER
BVDV-PROTEINE
NACH
COTRANSFEKTION
VON
REKOMBINANTER
SINDBIS-REPLIKON
UND
HELFER-RNA
67
4.23
KLONIERUNG
DER
BVDV-STRUKTURGENE
IN
DIE
AUF
DNA-TRANSFEKTION
BASIERENDEN
EXPRESSIONSVEKTOREN
PSIN987
UND
PCDNA3.1/MYC-HIS(+)C
70
4.2.4
PROTEINEXPRESSION
NACH
TRANSFEKTION
DER
REKOMBINANTEN
DNA-VEKTOREN
IN
BHK-21-ZELLEN
71
4.3
EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
STRUKTUR
PROTEINE
NACH
TRANSFEKTION
UND
INFEKTION
VON
ZELLEN
74
43.1
PASSAGE
UND
TITERBESTIMMUNG
REKOMBINANTER
SINDBISVIREN
74
43.2
NACHWEIS
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
EXPRESSION
REKOMBINANTER
BVDV
STRUKTURPROTEINE
DURCH
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
77
4.3.2.1
IMMUNFLUORESZENZDETEKTION
DER
B
VD
V-PROTEINE
EYY
UND
E2
AN
DER
ZELLOBERFLAECHE
80
4.3.2.2
EXPRESSION
VON
BVDV-STRUKTURPROTEINEN
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
ZEIT
NACH
INFEKTION
MIT
REKOMBINANTEN
SINDBISVIREN
(,
TIME
COURSE
"
)
85
433
DETEKTION
REKOMBINANTER
BVDV-STRUKTURPROTEINE
NACH
IMMUNPRAEZIPITATION
89
4.4
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
BVDV-STRUKTURPROTEINE
IM
TIERVERSUCH
93
4.4.1
IMMUNISIERUNG
MIT
REKOMBINANTEN
SINDBISVIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
93
4.4.1.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
93
4.4.1.2
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
103
INHALTSVERZEICHNIS
5
DISKUSSION
107
5.1
EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
BVDV-STRUKTURPROTEINE
IN
AUF
RNA
UND
DNA-TRANSFEKTION
BASIERENDEN
VEKTORSYSTEMEN
107
5.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
BVDV-PROTEINEN
IM
TIERVERSUCH
113
5.2.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
114
5.2.2
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
118
6
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
122
7
LITERATUR
126
8
ANHANG
142
8.1
MATERIALLISTE
142
8.1.1
GERAETE
UND
LABORHILFSMITTEL
142
8.1.2
ENZYME
143
8.13
KOMMERZIELLE
KITS
143
8.1.4
ZELLEN,
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
143
8.1.5
CHEMIKALIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
144
8.2
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
150 |
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