Die Phosphopantethein:Protein-Transferasedomäne der Fettsäuresynthase aus Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 108 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
I.
ZUSAMMENFASSUNG
1
II.
EINLEITUNG
2
III.
MATERIAL
UND
METHODEN
12
1.
SPEZIELLE
CHEMIKALIEN
12
2.
PROTEINE
UND
DNA
12
3.
SONSTIGE
ARBEITSMATERIALIEN
12
4.
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDPUFFER
13
4.1.
LOESUNGEN
FUER
DIE
ISOLIERUNG
UND
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
13
4.2.
LOESUNGEN
FUER
DIE
SDS-PAGE
VON
PROTEINEN
13
5.
VERWENDETE
ORGANISMEN
13
5.1.
ECO/R-STAEMME
13
5.2.
HEFESTAEMME
13
5.2.1.
VORHANDENE
STAEMME
14
5.2.2.
IM
RAHMEN
DIESER
ARBEIT
KONSTRUIERTE
STAEMME
14
6.
NAEHRMEDIEN
15
6.1.
KULTURMEDIEN
FUER
E.COLI
15
6.2.
KULTURMEDIEN
FUER
HEFE
15
7.
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
16
7.1.
KLONIERUNGSVEKTOREN
16
7.1.1.
E.CO/AVEKTOREN
16
7.1.2.
S.CEREVIS/AE/E.CO/R
"
SHUTTLE"
-VEKTOREN
16
7.2.
VORHANDENE
PLASMIDE
17
7.3.
IM
RAHMEN
DIESER
ARBEIT
KONSTRUIERTE
PLASMIDE
17
8.
OLIGONUKLEOTIDE
17
8.1.
OLIGONUKLEOTIDE
(PCR-PRIMER)
18
9.
KULTIVIERUNG
VON
MIKROORGANISMEN
18
9.1.
ANZUCHT
VON
E.CO//-ZELLEN
18
9.2.
ANZUCHT
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE-ZEWEN
19
10.
ZELLDICHTEBESTIMMUNG
19
11.
ZELLROHEXTRAKTE
AUS
HEFE
19
11.1.
KALTER
AUFSCHLUSS
"
19
12.
PROTEINBESTIMMUNG
19
12.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
METHODE
VON
BRADFORD
19
13.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ECO//
20
13.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIMBOIM/DOLY
20
13.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
YYQIAGEN
"
-MINISAEULEN
20
13.3.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
ZUR
YYMINI-SCREEN
"
-ANALYSE
21
13.4.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
HEFE
21
13.5.
FAELLUNG
VON
DNA
DURCH
NA-ACETAT
UND
ETHANOL
22
14.
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
22
15.
ELEKTROPHORETISCHE
TECHNIKEN
22
15.1.
ANALYTISCHE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
22
15.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
DEM
YYQIAEX
II
22
GELEXTRAKTIONSKIT
DER
FIRMA
QIAGEN
15.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
MIT
DEM
QIAQUICK
23
GELEXTRAKTIONS-KIT
15.4.
ELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
BEI
DER
DNA-SEQUENZIERUNG
23
15.5.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
24
15.6.
TROCKNEN
VON
SDS-PAA
GELEN
MIT
DEM
YYGEL
DRYING
KIT
"
VON
PROMEGA
25
16.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
DNA
26
16.1.
RESTRIKTIONSENDONUKLEASE-SPALTUNG
VON
DNA
26
16.2.
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG
26
16.3.
LIGATION
VON
DNA
27
17.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
27
17.1.
PCR
ZUR
AMPLIFIKATION
VON
GENOMISCHER
BZW.
PLASMID-DNA
27
17.2.
IN
VITRO
SYNTHESE
SPEZIFISCHER
DNA-FRAGMENTE
MIT
HILFE
DER
YYDEEP
VENT
"
28
POLYMERASE
17.3.
PCR
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA
AUS
GANZEN
ZELLEN
(YYWHOLE
CELL
PCR
")
28
17.4.
AUFREINIGUNG
AMPLIFIZIERTER
DNA-FRAGMENTE
MIT
DEM
YYNUCLEOTRAPCR
29
EXTRACTION
KIT
"
17.5.
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
MIT
DEM
QIAQUICK-SPIN
PCR
PURIFICATION
29
KIT
(QIAGEN)
18.
TRANSFOERMATIONSTECHNIKEN
30
18.1.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
NACH
DER
CALCIUMCHLORID-METHODE
30
18.2.
HEFETRANSFORMATION
NACH
DER
LITHIUMACETAT-METHODE
30
19.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDESOXY-TERMINATIONSMETHODE
31
19.1.
DENATURIERUNG
DES
DOPPELSTRANGES
31
19.2.
SEQUENZIERREAKTIONEN
31
19.3.
AUTORADIOGRAPHIE
DER
SEQUENZIERGELE
32
20.
WESTERN-ANALYSE
32
20.1.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
AUF
NITROZELLULOSE
32
20.2.
IMMUNKOMPLEX-BILDUNG
UND
NACHWEIS
DURCH
ELISA
MITTELS
PROTEIN
AZ
33
MEERRETTICHPEROXIDASE-KONJUGAT
(HRPC)
20.3.
IMMUNKOMPLEX-BILDUNG
UND
NACHWEIS
DURCH
ELISA
MITTELS
ANTI-MAUS
33
IGG/
MEERRETTICHPEROXIDASE-KONJUGAT
(HRPC)
21.
ISOLIERUNG
DES
FETTSAEURESYNTHASE-KOMPLEXES
AUS
S.
CEREVISIAE
34
21.1.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
34
21.2.
ZELLAUFSCHLUSS
UND
FAS-ISOLIERUNG
34
22.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
MIT
HILFE
DES
QIAEXPRESS
35
SYSTEMS
DER
FIRMA
QIAGEN
22.1.
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
FAS2-TEILDOMAENEN
UND
DEREN
35
FUSIONSKONSTRUKTEN
MIT
HILFE
DES
QIAEXPRESS-SYSTEMS
DER
FIRMA
QIAGEN
22.2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
INTAKTEN
FAS
A-KETTE
36
22.3.
AUFSCHLUSS
VON
E.CO/J-ZELLEN
MITTELS
ULTRASCHALL
UND
AUFREINIGUNG
DER
36
HETEROLOGEN
PROTEINE
MIT
HILFE
DES
QIAEXPRESS-SYSTEMS
DER
FIRMA
QIAGEN
22.4.
HOMOLOGE
EXPRESSION
DER
INTAKTEN
FAS-UNTEREINHEITEN
UND
DES
FAS
37
KOMPLEXES
22.5.
GLASPERIENAUFSCHLUSS
DER
HEFE-ZELLEN
UND
AUFREINIGUNG
DER
HOMOLOGEN
37
PROTEINE
MIT
HILFE
DES
QIAEXPRESS-SYSTEMS
DER
FIRMA
QIAGEN
22.6.
REINIGUNG
DER
NI
2+
-SAEULENMATRIX
37
23.
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
38
23.1.
KONZENTRIERUNG
VON
ZELLROHEXTRAKT
38
24.
IN
WVO-MARKIERUNG
DER
INTAKTEN
HETEROLOGEN
FAS
A-KETTE
MIT
'
4
C-SS-ALANIN
38
25.
IN
VIVO-MARKIERUNG
DER
HOMOLOG
EXPRIMIERTEN
FAS
A-KETTE
MIT
14
C-SS-ALANIN
38
BZW.
14
C-PANTOTHENSAEURE
26.
FLUOROGRAPHIE
VON
14
C
MARKIERTEN
PROTEINEN
39
27.
FLUESSIGSZINTILLATIONSZAEHLUNG
VON
14
C-MARKIERTEN
PROBEN
39
28.
INTRAGENE
IN
VITRO
KOMPLEMENTATION
ZUR
BILDUNG
EINES
APO-FAS
39
MISCHKOMPLEXES
28.1.
DISSOZIATION
UND
REASSOZIATION
NACH
DER
DMMA-METHODE
39
28.2.
INTRAGENE
KOMPLEMENTATION
PANTETHEIN-FREIER
FETTSAEURESYNTHASEN
ZU
40
EINEM
HOLO-FAS
MISCHKOMPLEX
29.
FAS-AKTIVITAETSTEST
40
29.1.
GESAMTREAKTION
40
29.2.
SS-KETOACYLREDUKTASE-REAKTION
40
29.3.
AUSWERTUNG
41
IV.
ERGEBNISSE
42
1.
EXPERIMENTE
ZUR
IN
VITRO
PANTETHEINYLIERUNG
DES
APO-FAS-KOMPLEXES
DER
42
MUTANTE
FAS2-158
(SC
1324)
1.1.
KLONIERUNG
DER
C-TERMINALEN
PPTASE-DOMAENE
VON
FAS2
ZUR
HETEROLOGEN
42
EXPRESSION
IN
E.COLI
1.2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
C-TERMINALEN,
HIS-TAG
MARKIERTEN
DOMAENE
VON
43
FAS2
UND
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
EXPRIMIERTEN
PROTEINS
UEBER
NI
2+
-AGAROSE
1.3.
VERSUCHE
ZUR
IN
VITRO
AKTIVIERUNG
VON
APOFAS
AUS
HEFE
45
1.3.1.
INKUBATION
VON
APOFAS
MIT
DEM
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
C-TERMINALEN
45
BEREICH
VON
FAS2P
1.3.2.
INKUBATION
DES
APOFAS-KOMPLEXES
AUS
DER
MUTANTE
FAS2-158
MIT
DEM
46
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
PPT1-PROTEIN
AUS
B.
AMMONIAGENES
1.3.3.
VERSUCHE
ZUR
AKTIVIERUNG
VON
APOFAS
MIT
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
46
PPTASE
SFP
AUS
BACILLUS
SUBTILIS
2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DES
VOLLSTAENDIGEN
FAS2-LESERAHMENS
IN
E.COLI
49
2.1.
KLONIERUNG
DES
PHAGEN-PROMOTORS
T5
VOR
DEN
FAS2-LESERAHMEN
49
2.2.
EINBAU
EINER
HEXAHISTIDIN-SEQUENZ
UND
EINES
BAKTERIELLEN
TERMINATORS
50
HINTER
DEN
FAS2-LESERAHMEN
IN
DEM
PLASMID
PSPM5
2.3.
KLONIERUNG
EINES
FUSIONSKONSTRUKTES
AUS
ACP
UND
PPTASE-DOMAENE
VON
51
FAS2
IN
DEN
BAKTERIELLEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PQE70
2.4.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
VOLLSTAENDIGEN
FAS
A-KETTE
IN
E.COLI
52
2.5.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DES
IM
PSPM16
MONIERTEN
FAS2-GENS
IN
E.COLI
53
PAND
ZELLEN
3.1.
IN
V/VO-MARKIERUNG
DER
FAS
A-KETTE
MIT
M
C-SS-ALANIN
IN
SPM11
55
TRANSFORMIERTEN
E.CO//DH5A-ZELLEN
3.2.
VERSUCH
DER
IN
WVO-PANTETHEINYLIERUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
AUS
DER
ACP
57
UND
DER
PPTASE-DOMAENE
DER
FAS
A-KETTE
IN
PSPM16
TRANSFORMIERTEN
E.COLI
DH5A-ZELLEN
(PAND)
4.
HOMOLOGE
EXPRESSION
UND
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
VOLLSTAENDIGE
FAS2P-GENPRODUKTES
IN
HEFE
57
4.1.
KLONIERUNG
DES
FAS2
6XH
IS
HEFEEXPRESSIONSVEKTORS
PCA35
59
4.2.
HOMOLOGE
EXPRESSION
DER
VOLLSTAENDIGEN
FAS
A-KETTE
IN
HEFE
61
4.3.
IN
V/VO-MARKIERUNG
DER
FAS
A-KETTE
MIT
14
C-SS-ALANIN
IN
HEFE-ZELLEN
63
4.4.
IN
V/VO-MARKIERUNG
DER
FAS
A-KETTE
MIT
14
C-SS-ALANIN
IN
DER
SS-ALANIN
BEDUERFTIGEN
MUTANTE
SC
1417
64
5.
INTRAGENE
KOMPLEMENTATION
DES
BIOCHEMISCHEN
DEFEKTES
DER
PANTETHEIN
FREIEN
MUTANTE
FAS2-158
(SC
1324)
68
5.1.
KOMPLEMENTATION
DER
MUTANTE
FAS2-158
(SC
1324)
MIT
DEM
KONSTRUKT
YCP2MM
68
6.
HOMOLOGE
EXPRESSION
UND
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
MUTANTENPROTEINE
FAS2-158P
UND
FAS2-MMP
71
6.1.
HERSTELLUNG
DER
EXPRESSIONS-PLASMIDE
PCA40
UND
PCA46
FUER
DIE
MUTIERTEN
FAS2
GENE
FAS2-158
UND
FAS2-MM
71
6.2.
HERSTELLUNG
DES
FAS2-MMSXHIS
EXPRESSIONSPLASMIDES
PCA51
73
6.3.
KOMPLEMENTATION
DER
PPTASE-MUTANTE
FAS2-158
(SC
1324)
MIT
DEM
PANTETHEIN-FREIEN
FAS2-MM-GEN
IN
PCA51
78
6.4.
HOMOLOGE
EXPRESSION
DER
FAS
A-UNTEREINHEIT
DER
MUTANTE
FAS2-158
6X
HS
IN
HEFE
78
6.5.
HOMOLOGE
EXPRESSION
DER
FAS
A-UNTEREINHEIT
DER
MUTANTE
FAS2-MMEXHI
IN
HEFE
80
7.
HOMOLOGE
EXPRESSION
UND
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
FAS1-GENPRODUKTES
81
7.1.
KLONIERUNG
DES
FAS1
6LMS
HEFEEXPRESSIONSPLASMIDES
PCA50
81
8.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
EINES
ENZYMATISCH
AKTIVEN
FAS
KOMPLEXES
AUS
S.CEREVISIAE
84
8.1.
KOMPLEMENTATION
DER
AFAS1/AFAS2-DOPPELMUTANTE
PWY12
MIT
DEN
PLASMID-KODIERTEN
GENEN
FAS1
6XH
IS
UND
FAS2
6
J
HIS
84
8.2.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
HEXAHISTIDIN-MARKIERTEN
FAS-KOMPLEXES
84
8.3.
REVERSIBLE
DISSOZIATION
DES
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCH
GEREINIGTEN
FAS
KOMPLEXES
DURCH
ACYLIERUNG
MIT
DMMA
86
9.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
PANTETHEIN-FREIEN
FAS
KOMPLEXE
AUS
DEN
MUTANTEN
FAS2-158
UND
FAS2-MM
90
9.1.
EXPRESSION
DER
HEXAHISTIDIN-MARKIERTEN
FAS-KOMPLEXE
FAS2-158
UND
FAS2-MM
90
10.
INTRAGENE
KOMPLEMENTATION
ZWISCHEN
DEN
FAS
-UNTEREINHEITEN
DER
92
MUTANTEN
FAS2-MM
UND
FAS2-158
10.1.
IN
VITRO
PANTETHEINYLIERUNG
DES
FAS2-158
UND
FAS2-MM
FAS
92
MISCHKOMPLEXES
IN
GEGENWART
VON
COENZYM
A
V.
DISKUSSION
96
VI.
ANHANG
102
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
104 |
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